利用显微注射技术分析人源HeLa细胞中剪接体snRNA的定位

在此，我们采用荧光标记RNA的显微注射技术，以检测短核RNA定位于核内称为卡哈尔体（Cajal bodies）的核结构所必需的RNA序列。该技术具有两个主要优势。首先，该方法适用于其他方法难以标记和追踪的短RNA。

其次，它能够快速筛选不同的序列并检测其在RNA定位中的作用。显微注射前一天，将HeLa细胞或其他贴壁细胞接种于12毫米的盖玻片上，使其在显微注射时达到50%的汇合度。开始时，将准备好的盖玻片放入培养皿中央，加入细胞和2毫米的培养基。

第二天，将含有细胞的培养皿放置在显微镜载物台上。使用微加载器将三微升的snRNA混合物吸入针头中，并将针头以相对于培养皿表面45度的角度安装到显微注射仪的针 holder 中。使用10倍长工作距离物镜寻找针头。

首先，将显微注射仪的速度调至粗调档，降低针头直至其接触培养基。通过显微镜双目镜观察，找到针头接触培养基时产生的亮斑。将速度切换至细调档，并在显微镜下继续缓慢降低针头，直至观察到针尖末端。

将针移动到视野中央，切换至40倍长工作距离物镜。随后选择细胞，并将针移至细胞上方。设置细胞接触所需的压强和时间。

将针头向下移动进入细胞，然后设定显微操作仪的下限位置。设定下限是本实验方案中最关键的步骤。由于盖玻片表面并非完全平整，且每个细胞的情况各不相同，因此在注射过程中需要多次重新设定下限位置。

接下来，将针头移回细胞上方，按下显微注射仪操纵杆上的注射按钮。针头将自动进入细胞内，到达预设位置后注入RNA混合物。操作完成后，按下注射仪上的菜单按钮，从持针器中取出针头。

然后在关闭注射器和显微操作仪之前，将管路从注射器上断开。显微注射后，将细胞放回二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下孵育1小时。接着在室温下用PBS洗涤细胞三次。

用 pH 6.9 的 0.1 摩尔 Pipes 缓冲液中含 4% 多聚甲醛固定细胞 20 分钟。随后用室温 PBS 洗涤细胞三次。若仅分析 snRNA 定位，则用清水短暂漂洗细胞，并用含 DAPI 的封片剂封片。

如果需要进行额外的蛋白质定位，用含0.5% Triton X-100的PBS在室温下对细胞透化处理5分钟。用PBS冲洗细胞三次，然后按照文本方案中所述，使用相应的一抗和二抗进行染色。接着用PBS冲洗三次，再用纯水冲洗一次。

此后，将细胞置于含 DAPI 的封片剂中封片。准备成像时，使用配备浸油物镜的高端荧光显微系统采集图像。确定显微注射的细胞后，对每个样本采集 20 个 Z 轴切片，Z 轴步长为 200 纳米，并进行数学去卷积处理。

为了定量荧光信号，首先在 ImageJ 中打开显微镜图像，并将各通道拆分为独立窗口。使用窗口同步工具使各窗口同步。接着，围绕由 coilin 免疫染色鉴定的 Cajal 小体绘制感兴趣区域。

测量coilin定义的ROI中snRNA信号的强度。在核质中随机放置ROI，测定snRNA荧光的强度。保存测量值，并计算Cajal小体与核质中RNA信号的比值。

在本研究中，通过显微注射荧光标记的snRNA，以监测其在细胞内的转运过程。为了检测SM位点是否对 Cajal 小体的聚集具有重要性，将缺乏SM位点的snRNA直接显微注射到细胞核内。将RNA注射至细胞质作为对照，而全长snRNA的显微注射则作为阳性对照。

孵育后，对显微注射的细胞进行固定，并通过间接免疫荧光法检测 Cajal 小体标记蛋白 coilin。全长 snRNA 在细胞核和细胞质注射后均积累于 Cajal 小体中。相比之下，缺乏 SM 位点的 snRNA 在注射到细胞质后仍滞留在细胞质中；而将缺乏 SM 位点的 snRNA 注射到细胞核内则表明，SM 结合序列对 snRNA 定位于 Cajal 小体至关重要，因为该 snRNA 虽保留在细胞核内，但无法在 Cajal 小体中积累。

有时仅向一个细胞区室进行显微注射会失败，导致70千道尔顿的葡聚糖出现在细胞核和细胞质中。这些细胞将被弃用，不再用于后续分析。尽管荧光标记的snRNA在注射前保存在负80摄氏度条件下，但仍可能发生RNA降解。

注入细胞质后发生降解的snRNA不会被转运至细胞核，而是滞留在细胞质中。此类snRNA应予以弃用，并重新合成新的snRNA。针对特定细胞类型，正确调节注射压力和补偿压力至关重要。

如前所述，设定正确的细胞注射下限对于一次成功的显微注射至关重要。请务必注意，RNA 提取过程中使用的苯酚-氯仿具有危险性，显微注射针为锐利物品。在操作这些材料时应格外小心。