合成氘代标准品用于定量2-花生四烯酰甘油 秀丽隐杆线虫

内源性大麻素是一类保守的脂质介质，在多种生物体中调控多种生物学过程。最早发现的内源性大麻素是花生四烯酸乙醇胺和2-花生四烯酰基甘油（2-AG）。线虫C.elegans是研究多种生物学过程的有力动物模型。

最近，我们发现 2-AG 在秀丽隐杆线虫（C.elegans）胆固醇转运调控中发挥着基础性作用。因此，设计并优化一种用于检测和定量线虫内源性 2-AG 的方法变得至关重要。以往报道的用于定量生物样本中 2-AG 的分析方法通常需要使用氘代标准品，而这些标准品需通过商业途径获得。

然而，这些标准品价格昂贵，并且由于含有多个双键，随时间推移容易被氧化。目前最常见的标准品以八氘代花生四烯酸为基础，适用于通过同位素稀释法、液相色谱及后续质谱分析进行定量。为了克服氘代标准品在定量2-AG时存在的成本高和稳定性差的问题，我们采用了一种简便且实用的方法，以氘代-5-甘油为原料制备分析标准品。

制备全氘代内标的标准品需经过三步反应过程。该标准品可保持在保护形式下保存，直至需要时使用。本研究的主要目的是展示一种完整的方法，用于从分析用氘代内标的合成、线虫样品的制备与提取，到最后通过液相色谱-质谱联用技术对秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的2-AG进行分析的全过程研究。

为了获得氘代1-AG作为定量分析中的氘代内标物，请遵循三步法操作。首先，使用巴斯德移液管将38毫克氘代甘油加入10毫升反应管中，以仅保护伯醇基团，并向管中加入磁力搅拌子。接下来，使用5毫升汉密尔顿注射器加入5毫升无水二氯甲烷（DCM），并向反应管中通入干燥氮气，以提供惰性气氛。

使用一个浅的杜瓦瓶，装入蒸馏过的乙酸乙酯，制备冷却浴。将密闭的反应管放入该冷却浴中，然后缓慢地将液氮加入乙酸乙酯中，直至溶剂完全冻结。注意：液氮在室温下会剧烈沸腾，若接触眼睛或皮肤，可能造成严重灼伤。

接下来，使用汉密尔顿注射器加入54毫克无水 collidine。注意：collidine 具有挥发性，且气味强烈难闻。加入70毫克叔丁基-二甲基-十六烷基氯化物，在磁力搅拌器上于-78摄氏度搅拌反应物3小时。

加入两毫升盐水以终止反应。使用分液漏斗，每次用两毫升蒸馏过的二氯甲烷对溶液萃取一次，共萃取三次，每次均保留有机相。随后，合并三次得到的有机相，并用亚硫酸钠干燥。

使用硅胶作为固定相，通过柱色谱法纯化粗混合物，采用从100%正己烷开始至100%乙酸乙酯结束的10%递增正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱体系。进行此酯化反应步骤时，用巴斯德移液管将先前所述产物10毫克加入10毫升反应管中，并放入一个磁力搅拌子。用5毫升汉密尔顿注射器加入2毫升无水二氯甲烷，并通入干燥氮气使反应管内充满氮气，以提供惰性气氛。

使用冰浴将溶液冷却至零度。用多通道可调微量移液器加入36毫克花生四烯酸并搅拌。然后，加入15毫克40-甲基-氨基吡啶并搅拌。

使用多通道可调微量移液器加入15毫克二酰基丙基碳二亚胺并搅拌。加入2毫升水以淬灭反应，然后使用分液漏斗用2毫升蒸馏二氯甲烷萃取溶液三次。合并三次有机相萃取液，用亚硫酸钠干燥，再通过柱色谱法纯化粗产物，以硅胶为固定相，采用10%递增的己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，起始为100%己烷，最终为50:50%己烷-乙酸乙酯。

最后，在去保护步骤中，使用巴斯德移液管将15毫克先前合成的产物加入10毫升反应管中，并放入一个磁力搅拌子。用5毫升哈密尔顿注射器加入2毫升无水四氢呋喃，并用干燥氮气充满反应管以提供惰性气氛。然后将溶液置于冰浴中冷却至0摄氏度。

使用 Hamilton 注射器，将 150 微升 1 摩尔的四丁基氟化铵 THF 溶液逐滴加入。反应一小时后，加入 2 毫升水以淬灭反应。用分液漏斗以 2 毫升蒸馏二氯甲烷萃取溶液，重复三次。

合并三次有机相提取液，并用亚硫酸钠干燥。进行漂白处理时，将线虫转移至接种过的六厘米 NGM 平板上。让线虫生长两到三天，直至平板上出现大量虫卵和怀卵成虫。

获得大量虫卵和成虫后，向培养皿中加入 5 毫升 M9 溶液。使用玻璃移液管将线虫转移至 15 毫升 Falcon 管中。以 2,000 G 离心 2 分钟，使线虫沉淀成团。

吸出大部分M9溶液，注意不要扰动虫体沉淀。加入3 mL漂白液，轻轻颠倒混匀，持续约5分钟，或直至观察到完整成虫数量减少。待大部分虫体溶解后，在2,000 G离心1分钟。

吸出大部分漂白液，注意不要扰动虫体沉淀。向离心管中加入15毫升M9溶液，充分混匀。再次在2,000 G下离心1分钟。

吸出大部分M9缓冲液，注意不要扰动线虫沉淀。进行线虫样品制备时，将通过漂白法获得的N2胚胎在20摄氏度的M9缓冲液中孵育过夜。随后，以2,000 ×g离心2分钟收集同步化的L1幼虫。再用M9缓冲液洗涤线虫一次，并计数活L1幼虫的数量。将约10,000条线虫接种至NGM平板上，平板中已预先加入1毫升干燥的OP50大肠杆菌（Escherichia coli）。

将培养板在20摄氏度下至少孵育48小时，直至线虫发育至L4阶段。使用冷M9缓冲液将线虫收集至50毫升离心管中。再清洗一次后，转移至1.5毫升离心管中。

将线虫在2,000 G离心1分钟以形成沉淀。除去大部分上清液。然后将离心管浸入液氮中，并在-80摄氏度下搅拌。

解冻约100微升N2线虫冻存沉淀，加入1.3毫升甲醇。随后将样品超声处理4分钟。超声处理后，加入1,000 ppb的内标氘代标准品、2.6毫升氯仿，以及1.3毫升含有0.5摩尔氯化钾和0.08摩尔磷酸的溶液，最终比例为1:1。

将样品涡旋震荡1分钟，然后在冰上用超声水浴处理15分钟。再次涡旋震荡样品两次，每次1分钟，随后在2,000 G离心10分钟，以诱导相分离。收集下层相至洁净玻璃管中，用氮气吹干，并重新悬浮于100 µL乙腈中。

为了成功定量内源性2-AG，有必要通过三步法合成其饱和类似物。随后将其添加至线虫样品中，经提取后采用高效液相色谱-质谱联用技术进行分析。合成的氘代1-AG作为内标物，用于定量内源性代谢物。

该方法通过优化2-AG以及脱氢甘油部分丢失的氘代1-AG的离子跃迁进行。利用化学合成的氘代1-AG作为内标，结合同位素稀释法及高效液相色谱-质谱联用技术，成功检测并定量了秀丽隐杆线虫样品中的内源性2-AG。样品一添加了氘代标准品1-AG，而样品二未添加标准品。

由于样品一和样品三中氘代标准品的初始浓度均为 1,000 ppb，根据峰面积比值可计算出样品中内源性 2-AG 的浓度，样品一为 340 ppb，样品三为 360 ppb，平均浓度为 350 ppb。该比值是基于两个独立样品中 2-AG 与氘代 1-AG 的峰面积之比计算得出，这两个样品均在提取前添加了氘代标准品。

鉴于最近发现2-AG在促进胆固醇转运方面具有重要作用，而关于脂质如何影响该过程的信息仍十分缺乏，因此迫切需要一种可靠的内源性大麻素检测方法。本方案中的关键步骤是成功开发出一种简单且稳定的合成方法，用于制备氘代类似物2-AG。目前报道的大多数单酰基甘油定量方法均依赖于商业化的分析标准品，这些标准品通常价格昂贵，且在常规储存条件下不稳定，使得预算有限的实验室难以获得。

然而，该方法通过采用更易获得的起始原料来合成标准品，解决了上述问题。该合成方法简单直接，无需复杂的反应条件，因此非常适合在任何具备基本设备和试剂的实验室中进行，即使在经费有限的情况下也能完成。总之，这一新方法提供了一种简单直接且可重复的2-AG检测与定量手段，将有助于回答在揭示内源性大麻素在秀丽隐杆线虫胆固醇转运中的作用后所提出的一些问题。