Worm-align 和 Worm_CP：两款用于对来自 Caenorhabditis elegans 的荧光图像数据进行拉直和定量分析的开源流程

本文介绍了一种基于Fiji的简单开源工作流程，名为Worm-align，可用于从原始显微图像中生成目标线虫的单通道或多通道拉直拼接图像。由于该工作流程依赖于用户手动选择感兴趣的目标个体，因此在分析秀丽隐杆线虫（C.elegans）图像时尤为有用，特别是当图像中并非所有线虫均处于正确发育阶段或实验条件一致的情况下。需要注意的是，Worm-align的输出结果可用于后续荧光信号的定量分析，可结合Fiji或其他图像分析软件进行处理。

在此，我们演示使用 CellProfiler 流程 Worm_CP 进行荧光定量分析。首先，通过在本生灯火焰中拉伸一根细玻璃毛细管来制备口部微吸管。在火焰中拉伸后，若毛细管未自动断成两段，则将其折断为两段。

如果毛细管断裂成两段，需剪去较长一段的末端。选取较长的一段，通过尝试吸取水来检测毛细管是否通畅。将接头从一段3毫米的硅胶管上拆下。

将玻璃毛细管插入与一段6毫米硅胶管相连的毛细管接头中。然后将该6毫米硅胶管的另一端插入一个0.2微米滤器，并将一段3毫米硅胶管连接在滤器的另一端。将一个1毫米滤嘴尖端插入3毫米硅胶管的游离端，用于吸取液体。

在解剖显微镜下，用口控移液器尽可能吸除固定线虫沉淀周围的液体。迅速向管底加入 10 微升封片介质。用含微量去垢剂的 PBS 冲洗 10 微升吸头，以防止线虫粘附在塑料吸头内壁。

然后用剪刀剪去吸头的最末端。将8 µL封片剂连同线虫转移到预先制备好的琼脂糖垫上。在显微镜下观察载玻片时，轻轻晃动载玻片以避免线虫重叠。

然后用18 mm × 18 mm的盖玻片覆盖琼脂糖垫上的封片剂液滴。若要固定活体线虫，用移液器将3至4 µL含3 mM左旋咪唑的M9缓冲液滴加到琼脂糖垫上。每种条件下挑选30至50条线虫放入左旋咪唑液滴中。

然后用 18 × 18 毫米的盖玻片覆盖液滴，并在 1 小时内对线虫进行成像。从 ImageJ 下载并安装开源图像分析软件包 Fiji；如果计算机上已安装，请确认其版本为 1.52A 或更高版本，然后从 GitHub 下载 Worm-align 仓库并保存到计算机上。在所有流程组件下载并安装完成后，打开 Fiji，通过点击主菜单栏中的“插件”、“宏”、“运行”来执行 Worm-align 宏。

找到 Worm-align. ijm 脚本并点击打开。导航至包含待分析图像的输入文件夹，然后点击选择，确保所选文件夹中仅包含图像文件。

该宏将自动创建一个输出文件夹，用于保存所有结果。文件夹的名称与输入文件夹相同，并以“output”作为后缀。请允许该宏打开输入文件夹中的第一幅图像，并将其作为代表性图像，以提取生成拼接图所需的设置参数，包括线虫的宽度、亮度和对比度。

使用直线绘制工具，在蠕虫的宽度方向上画一条线，然后单击“确定”。利用此线的长度来确定单个蠕虫裁剪区域的高度。对于每个通道，指定其名称、查找表以及是否应包含在拼接图中，然后单击“确定”。接下来，使用滑块调整各通道的亮度和对比度设置。对剩余通道重复此过程。

所有设置配置完成后，系统会将这些设置记录在设置表中，并保存至输出文件夹的 CellProfiler 子文件夹内。系统将生成一张图像，用于预览应用这些设置后所有图像的效果。如果图像结果令人满意，请勾选顶部的复选框。

检查所有设置面板中的第二和第三个选项框指定了图像拼接生成的选项。保持这两个选项框均被选中，然后单击“确定”以执行宏的其余部分。若未选中顶部的选项框，将导致宏重新运行设置过程。

该宏随后将打开输入文件夹中的所有图像。对于每幅图像，使用分段线工具或自由手绘线工具，在需要包含在拼接图中的每条线虫的纵轴上绘制线条。绘制线条时应始终从头到尾或从尾到头，沿虫体全长保持一致，并通过按 Control T 将每条线添加到 ROI 管理器中。当所有目标线虫均被添加后，点击“确定”。Worm-align 随即会生成所选单条线虫的裁剪图像，并将其保存至输出文件夹的 single worm 子文件夹中。

所有选定线虫的拼接图像将保存在对齐文件夹中。请通过点击下载页面上“以前版本的CellProfiler”链接，并选择所需的操作系统，下载并安装CellProfiler 2.2.0。在启动Worm_CP流程之前，请确保在Worm-align输出文件夹的CellProfiler子文件夹中已存在所有预期的输出图像。

应提供原始图像的处理副本、线虫群体的二值图像掩膜、在选定线虫上绘制线条时的对齐掩膜，以及代表原始图像中每个通道的一幅图像。打开 CellProfiler，然后单击图像输入模块，将 CellProfiler 模块文件夹拖入显示“在此处放置文件和文件夹”的窗口中。如果此前分析留有图像列表，请先在窗口中右键单击，选择“清除文件列表”以移除这些图像。

单击元数据输入模块，在第二种提取方法上，单击黄色文件夹，然后浏览至 Worm-align 输出文件夹中的 CellProfiler 子文件夹。选择设置文件，然后单击更新。接下来，单击名称和类型输入模块，并确保管道所需的所有图像均存在。

运行流程前，在输出模块中选择输出结果的目标位置。通过点击“启动测试模式”并允许其运行文件夹中的第一张图像，使用测试模式查看流程的执行效果。当对流程的性能满意后，点击“退出测试模式”并分析图像。

开始分析之前，请确保分析模块前方的所有镜头均已关闭。分析完成后，打开 Worm_CP 输出文件夹，该文件夹包含两个 CSV 文件：worms CSV 和 lines CSV。按照本实验方案所述方法培养和成像秀丽隐杆线虫（C. elegans），可获得线虫群体的大量全景图像。

该流程的输出结果在很大程度上取决于在图像上绘制线条的质量。此处展示了若干条线示例及其在 Worm-align 中的输出结果。使用 Worm-align 脚本时，可通过数据子文件夹中的叠加图像以及拼接图中各个线虫的面板，对交叉的线虫进行视觉识别。

质控表还可用于识别重叠的线虫。然而，相交的线条会对 Worm_CP 分析流程造成问题，因为 Worm_CP 使用的是线状掩膜，而非感兴趣区域，来辅助识别单个线虫。

因此，CellProfiler 会将其中一条线虫分割为两个对象。Worm_CP 分析流程已用于定量经荧光染料标记的固定线虫中的荧光强度，该染料可掺入脂滴中。通过手动定量方法，野生型与突变型 DBL1 线虫之间的脂滴含量减少了 17%，而使用 Worm_CP 分析流程则减少了 12%。

Worm_CP 还被用于量化在热休克诱导基因调控下表达 GFP 的活体线虫中的热休克反应。在无热应激条件下，线虫不会诱导 GFP 表达。当线虫受到短暂热休克时，GFP 表达被诱导。

Worm_CP 的输出结果在很大程度上取决于使用 Worm-align 绘制的线条质量。请确保所绘制的线条互不接触、互不重叠，并且所有线条均沿同一方向绘制。检查质控表（QC table）有助于识别相互接触或重叠的线条，以便在分析中排除这些情况。

Worm-align 的输出结果可用于后续在 Fiji 或其他图像分析软件中进行定量分析。本文展示了一条非常基础的 CellProfiler 分析流程，其中可非常容易地引入其他分析模块，例如用于计数脂滴数量，或定量线虫内单个脂滴的荧光强度。该技术的一个优势在于能够快速对单条线虫的荧光信号进行定量。

在我们的实验室中，我们关注利用荧光报告基因来研究个体存活能力，并常规使用 Worm-align 和 Worm_CP 来实现这一目的。