使用自制生物打印机对工程化生物膜进行三维图案化

利用细菌进行3D生物打印是一种新近开发的技术。本方案提供了一种简便的方法，用于构建由细菌3D打印而成的工程化生物膜。该技术的主要优势在于能够使用低成本的自制3D打印机制造3D打印的生物膜。

我们3D打印机的一个可能应用是创建可重复的模型生物膜，用于开发新的抗菌疗法。我们的3D打印方法可适用于任何与基于海藻酸盐的生物墨水相容的细菌类型。生物墨水和打印基底的制备是相对标准的操作流程，而3D打印过程，特别是Z轴的校准，是需要一定实践经验的关键步骤。

设定喷嘴高度的校准将影响我们3D打印机的分辨率，且高度依赖于个人经验。该操作需要手动调整，难以用书面形式准确描述。将200微升移液器吸头连接到一段硅胶管上，并将该移液器吸头安装至3D打印机的挤出头上，以替代原有的挤出装置。

接下来，将4毫升5摩尔的氯化钙溶液加入400毫升溶于LB肉汤的1%琼脂中，并补充适当的抗生素和诱导剂。然后，将20毫升LB琼脂溶液分装至每个150毫米×15毫米的培养皿中。在室温下将培养皿盖半开，干燥30分钟。

制备3%的海藻酸钠溶液，并加热至沸腾三次以灭菌。然后将无菌溶液储存在4摄氏度，直至使用。为制备生物墨水的细菌组分，将携带组成型表达GFP质粒的大肠杆菌在含有抗生素的50毫升LB培养基中培养。

将培养物在37摄氏度、250 RPM条件下振荡培养过夜。培养过夜后，在3,220 ×g离心5分钟收集细菌沉淀，并弃去上清液。用10毫升LB培养基重悬细菌沉淀，然后加入10毫升3%海藻酸钠。

将3D打印机连接到计算机，并打开3D打印软件。点击X、Y和Z轴的“归位”按钮，使打印头移动到初始位置。每次打印时，将准备好的打印基板放置在打印平台的特定位置上。

在手动控制下将打印头抬升至超过 22 毫米的高度，以避免其在移动过程中与培养皿边缘发生碰撞。将打印头移至培养皿正上方，并向下移动，直至移液管尖端接触打印表面。将此 Z 轴位置设定为 Z1，即打印表面的高度。

接下来，抬起打印头并手动将其移至培养板区域之外。如果打印头与培养板表面之间的工作距离定义为 Z2，则在打印程序中将打印表面高度加上工作距离作为打印时的 Z 值输入。加载包含打印目标形状指令的预编程 G 代码文件。

在每个命令行中，可改变打印头在 X、Y 和/或 Z 轴上的位置。在所有打印步骤中，务必输入 Z 值，该值应为打印表面高度加上工作距离。将液态生物墨水装入注射器，并将其安装到 3D 生物打印机的注射泵中。

然后，将挤出速度设置为 0.3 毫升每小时。通过单击“打印”按钮，将生物墨水打印到打印基材上。在打印开始后、打印头接触打印表面之前，再启动注射泵。

打印过程中，完全通过软件控制打印头的移动。当打印头到达打印终点时，立即停止注射泵，否则多余的生物墨水会滴落在打印基底上，降低打印分辨率。对于三维结构的构建，打印头的所有移动均由G代码编辑器控制。

为了增加第二层的打印高度，输入第一层的打印高度，并在代码中将 Z 值增加 0.2 毫米。此后，每升高一层，Z 值增加 0.1 毫米。将打印后的样品在室温下孵育三至六天，以促进生物膜组分（如 Curlin 纤维）的生成。

然后，将培养板置于荧光扫描仪上成像。为溶解海藻酸盐基质，向打印的基质中加入 20 毫升 pH 7 的 0.5 摩尔柠檬酸钠溶液。在室温下孵育培养板，同时以 30 转/分钟振荡 2 小时。

然后，弃去液体，再次对平板进行成像，以与柠檬酸盐处理前后的平板图像进行比较。3D生物打印机能够制造出包埋细菌的水凝胶，形成多种二维和三维结构。这些打印结构可用于评估生物膜的形成是否成功，或通过柠檬酸钠溶液是否已完全溶解海藻酸盐基质。

对于不含可诱导Curli生成质粒的生物墨水，经柠檬酸钠处理后，打印图案完全溶解，表明未形成生物膜Curli网络。含有可诱导Curli生成质粒的细菌在经过柠檬酸钠处理后未被溶解，说明打印的细菌能够形成足够广泛的Curli网络，从而稳定细菌的打印图案。为了构建多层结构，可通过控制G代码编辑器打印额外的层。

增加样品的打印层数会导致打印结构的宽度和高度逐步增加。当将经基因工程改造后可诱导表达Curli蛋白的大肠杆菌（E.coli）打印成多层结构时，柠檬酸钠处理不会使样品溶解；而含有非Curli蛋白表达型大肠杆菌的多层结构则会被溶解。3D打印过程中最关键的步骤是Z轴的校准，以及打印启动与注射泵启动之间的协调。

为此工艺开发的生物墨水相对较软，韧性较低。可对生物墨水进行进一步改性，以提供并改善其机械稳定性。该3D打印技术能够制备具有优异机械性能的生物膜，有望用于制造仿生材料。

处理这些细菌时，应佩戴适当的防护装备，例如手套。