用于研究叶际和蔬菜发酵中微生物组组装的无菌系统

通过本实验方案，我们可以探究微生物在叶表环境中如何组装及相互作用的关键问题。该方法还有一个额外优势：通过使用无菌的蔬菜提取物，可将叶表微生物群落的结构与其在蔬菜发酵过程中的功能联系起来。这些技术使科学家能够验证微生物在叶表环境中的相互作用，并追踪这些叶表微生物群落如何影响发酵过程。

为了对白菜种子进行表面灭菌，首先将100粒种子放入一个1.5毫升的微量离心管中。向管中加入1毫升70%乙醇，涡旋振荡5分钟。然后用移液器吸除乙醇。

加入1毫升50%次氯酸钠溶液，涡旋振荡管子5分钟，然后弃去次氯酸钠溶液。用1毫升灭菌去离子水冲洗种子，涡旋振荡管子后弃去水，重复此步骤共冲洗四次。最后一次冲洗后，将种子浸泡在灭菌去离子水中2至8小时，以软化种皮，随后进行种植。

称取10克洁净的钙粘土放入一根15厘米×2.5厘米的玻璃试管中。向每根试管中加入约9毫升配制好的MS肉汤，以浸没钙粘土。用22毫米双通试管帽松松地盖住玻璃试管。

在 121 摄氏度下对试管进行高压灭菌 60 分钟。从高压灭菌器中取出试管时，将管盖推入玻璃试管以密封，然后将试管冷却至室温后再使用。待试管冷却后，使用超长镊子将一颗无菌白菜种子轻轻放入每支试管的中央。

将试管放入七孔托盘中，并将托盘置于光照培养架下，在24°C条件下进行16小时光照周期培养。种子在五天后将长出第一片真叶，即子叶形成后的第一片具维管组织的叶片。该叶片边缘呈皱褶状，并密布腺毛。

为了检测无菌白菜的无菌性，用灭菌镊子轻轻夹住植株基部并将其拔出。在将白菜完全从试管中取出之前，用灭菌的解剖剪小心剪去根部。然后，将白菜叶片压实至1.5毫升微量离心管中。

向每个微量离心管中加入 400 µL PBS，并使用无菌的微型研磨杵匀浆白菜。用宽口移液器吸头将 100 µL 白菜匀浆液涂布于琼脂平板上。为制备接种菌株的甘油保存液，需轻轻划线分离单个菌落至两到三个相同培养基的新平板上。

将菌落培养两到五天，然后用15毫升15%甘油将其从平板上刮下，收集至15毫升锥形管中。充分涡旋振荡管子以混匀。取1毫升混匀的甘油菌种分装至微量离心管中，其余14毫升甘油菌种一同于-80摄氏度保存，直至使用。

使用前一周，将1毫升分装样品置于冰上解冻，并进行不同倍数的稀释，以确定接种液的浓度。准备接种白菜时，将甘油保存菌种置于冰上解冻，并稀释至所需浓度。取10毫升稀释后的菌液加入无菌喷瓶中，向一个较大的废液收集烧杯中喷洒五次。

打开卷心菜管的盖子，将卷心菜管倾斜朝向喷雾瓶。每株卷心菜喷洒三泵接种液，然后收获部分卷心菜以评估实际的接种浓度。收获卷心菜时，使用灭菌镊子将其从管中取出。

用无菌解剖剪剪去根部，并小心将其放入预先称重的无菌微量离心管中。记录卷心菜的重量，以供后续计算使用。向每支含有卷心菜的离心管中加入 400 µL PBS，用微型研杵研磨 30 次，然后使用宽口移液器吸头将卷心菜匀浆接种到平板上。

去除并丢弃卷心菜最外层的叶片，将剩余的卷心菜切碎至适合放入搅拌机。将其搅打成细浆，称取卷心菜匀浆的质量。按每克卷心菜加入2毫升蒸馏水。

然后将卷心菜匀浆通过两层篮式咖啡滤纸过滤。将滤液分装至离心管中，在20,000 × g条件下离心20分钟，或直至大颗粒物质完全沉淀。小心移除上清液，注意不要扰动沉淀的卷心菜残渣。

为了重现具有标准盐浓度的发酵条件，向提取物中加入2%（重量/体积）的氯化钠。使用连接真空泵的0.2微米滤器过滤蔬菜提取物，将其分装至无菌试管中，并在-80摄氏度下冷冻保存。种子灭菌方法已在多颗中国大白菜上进行测试，所有样本均表现出相似的生长速率。

然而，其他芸薹属物种的实验效果有限，因为这些植物在灭菌后要么发芽率较低，要么茎迅速伸长，形成细弱而不健康的植株。微生物分离物以单菌株分离物形式接种，或与其他分离物组合接种。每种处理方式下共测试了15株无菌白菜，并在接种后立即、第4天或第10天进行采收。

这些分离菌株在大白菜叶际中表现出快速生长。将两种酵母菌和三种细菌分别接种至由红甘蓝、青菜和大白菜制成的三种不同类型的无菌蔬菜提取物（SVE）中。通过将每种处理的5微升样品点种于MRS或YPD琼脂平板上，记录接种物在14天内的生长情况。

在整个发酵过程中对pH值的测定显示，乳酸菌能够将SVE酸化至pH值低于4的水平，表明该发酵产物可安全食用。这些方法虽专门应用于大白菜微生物组，但也可适用于其他植物体系。保持系统无菌可能具有挑战性，我们所概述的实验方案虽已详尽，但发现每一步骤均至关重要。