由开源实验室机器人自动完成的霰弹枪蛋白质组学样品处理

本方案采用自动化技术在质谱实验前进行蛋白质生化制备，从而提高蛋白质组学研究的通量并降低变异度。本方案使用一种低成本、可编程的液体处理系统，价格适中，可供更多实验室采用。我们提供了可修改的开源 Python 脚本，以便进一步开发。

本实验操作将由本实验室的硕士研究生 Milton Amaya 进行演示。首先，在文本编辑器中打开 noSP3_Digestion.py 脚本，并根据实验的具体要求，在“仅在此处自定义”（CUSTOMIZE HERE ONLY）部分设置相应的实验变量。

然后，打开 Opentrons 应用程序，将脚本上传至 Opentrons 应用程序中的“协议”（Protocol）选项卡。接下来，按照 Python 脚本中指定的位置，将所需的实验耗材和移液器放置到 OT2 平台的相应位置。随后，将碳酸氢铵溶液置于四合一管架的 A1 孔中，该管架顶部为 15 毫升加 50 毫升试管架盖；将蛋白质样品置于另一个四合一管架的 A1 孔中，该管架顶部为 2 毫升试管架盖。

将2毫升的低吸附蛋白管手动放入置于温控模块上方铝块孔中，从A1孔开始，垂直向下依次放置。然后，将DTT溶液放入四联管架的A6孔中，管架顶部配有2毫升管架盖。观察机器人将适量的碳酸氢铵缓冲液转移至铝块中的样品管内。

然后，手动确认机器人程序已暂停，并显示以下消息：“在继续执行方案之前，请确保已将DTT加入位于4号槽位的2毫升离心管架的A6位置。” 在确认DTT管的位置并打开管盖后，点击Opentrons应用程序中的“继续”按钮以继续操作。确保机器人将10 µL的DTT溶液转移至每个样本孔中，随后进行五次混合操作。

接下来，确认机器人程序已暂停，并显示消息：“确保关闭样本管的管盖”。然后，手动关闭各管的管盖，点击“继续”以恢复运行。等待机器人温控模块开始加热铝块，直至温度达到 55 摄氏度，随后孵育 5 分钟，使样本温度升至 55 摄氏度。

机器人将在此温度下保持30分钟，以使DTT充分还原蛋白质。在孵育期间，准备碘乙酰胺溶液，并用手动方式用铝箔包裹，避免暴露于光线下。孵育结束后，当机器人程序暂停并显示警告信息时，请务必打开样品管的管盖，脱去样品管的盖子，然后点击“继续”以恢复程序运行。

接下来，手动确认机器人程序是否已暂停，并显示警告信息：“在继续执行方案前，请确保已将碘乙酰胺加入位于4号槽位的2毫升离心管架的B6位置”。确认碘乙酰胺管所在管架位置并打开管盖后，点击“继续（Resume）”，并确保机器人将10 µL碘乙酰胺溶液转移至每个样品管中，随后进行五轮混匀。当机器人程序暂停并显示信息“关闭样品管管盖”时，请盖上样品管管盖，并用铝箔覆盖管盖，然后用一张干净的铝箔覆盖整个铝块，再点击“继续（Resume）”以继续运行程序。

等待样本在22摄氏度下孵育30分钟，并确保机器人温控模块在碘乙酰胺孵育完成后自动关闭。当机器人程序暂停并显示警告信息“确保胰蛋白酶已加入位于4号位点的2毫升离心管架的C6位置，然后继续实验流程”时，将胰蛋白酶溶液加入2毫升离心管架的C6孔中，管盖保持打开状态，然后点击“继续”以恢复程序。随后，当机器人程序再次暂停并显示警告信息“打开温控模块上样本管的管盖”时，打开样本管的管盖，然后点击“继续”以恢复程序。

等待机器人将10 µL胰蛋白酶转移至每个样品管中，随后进行五轮混匀。胰蛋白酶消化过夜后，使用台式微量离心机短暂离心样品，并将样品置于磁力管架上。两分钟后，用移液器小心转移上清液至一组新的蛋白质低吸附微量离心管中，并将样品保存在冰箱中。

接下来，在文本编辑器中打开 SP3_peptide_cleanup.py Python 脚本，并根据需要在“仅在此处自定义”部分指定实验变量。然后，将该脚本上传到 Opentrons 应用程序的“协议”选项卡中。

将所需的实验耗材和移液器放置在 Python 脚本中指定的 OT2 仪器平台相应位置，并确保磁力模块已通电并连接至机器人。将一个新的 2 毫升 96 孔深孔板放置在磁力模块上方。接下来，从 A1 孔开始，沿垂直方向依次将消化后的样品放入 2 毫升管架中。

然后，确保机器人将55微升消化后的样品转移至磁力模块上深孔板的各孔中。确认机器人程序已暂停，并显示以下提示信息：在继续执行程序之前，请确保已将准备好的磁珠加入位于4号位置的2毫升离心管架A6孔中。随后，在微型台式离心机中涡旋振荡SP3磁珠并短暂离心，然后将其放入2毫升离心管架的A6孔中，管盖保持打开状态。

确认机器人程序已暂停，并显示以下消息：在继续执行方案之前，请确保已在位于5号槽位的15毫升加50毫升离心管架的A4位置中加入80%乙醇。随后，将80%乙醇溶液加入管架的A4孔中，然后点击“继续”以继续操作。观察机器人将移液速度调整为慢速，从每个孔中吸取上清液，并将其排入废液管的过程。

等待机器人将移液速度恢复至默认值并释放磁力模块。当机器人程序暂停并显示消息“打开碳酸氢铵管盖”时，打开碳酸氢铵溶液管盖，然后单击“继续”以恢复程序。在此期间请保持待命，机器人将释放磁力模块，向每个孔中转移250 µL碳酸氢铵缓冲液，并立即混合10次。

然后观察机器人将移液速度调至缓慢，并将每孔中的上清液转移至废液管中。等待机器人向每孔加入 100 µL 碳酸氢铵缓冲液，并立即混合 10 次。确认机器人程序已暂停，并显示以下信息：在继续执行实验方案前，请确保已在 2 mL 铝块中放置新的收集管。

然后，在铝块中最初放置的最后一个样本管之后，立即放入一组新的低蛋白吸附微量离心管，点击“继续”以恢复运行。等待机器人将每个样本从碳酸氢铵缓冲液转移至新的2毫升离心管中。当机器人程序暂停并显示提示信息“在继续实验流程前，请确保胰蛋白酶已加入位于4号槽位的2毫升离心管架C6位置”时，将胰蛋白酶溶液加入2毫升离心管架的C6孔中（管盖保持打开状态），然后点击“继续”以恢复程序。

程序运行结束后，用石蜡膜包裹样品管盖，将所有样品转移至温控混匀仪中，在 37 °C 条件下以 1,000 RPM 震荡孵育 16 至 20 小时。对于 BSA 样品，共鉴定出中位数为 728 个肽段谱图匹配和 65 个肽段，其变异系数分别为 5.2% 和 3.2%。对于复杂的心脏组织样品，在 10 次重复实验中鉴定出中位数为 9,526 个肽段谱图匹配、7,558 个肽段和 1,336 个蛋白质，其变异系数分别为 7.6%、5.9% 和 3.6%。

为了确定肽段定量的变异性，计算了对应于唯一蛋白质的10个肽段的提取离子色谱强度的变异系数。进一步将人工与机器人实验在测定蛋白质浓度时的结果变异性与BCA法进行比较，结果显示，机器人BCA法的平均变异系数低于人工手动BCA法。该方案减少了每个样本处理所需的实验台操作时间。

这为我们探索多种药物处理下一系列细胞系之间的蛋白质组学差异铺平了道路。