利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）增强组织样本的多重检测能力

该增强型多重检测方法的总体目标是，在减少样本误差和仪器使用时间的同时，提高可同时分析的蛋白质样本数量。该方法有助于回答衰老、神经退行性疾病、其他年龄相关疾病以及癌症等领域中的关键科学问题，涉及发病机制、疾病进展、诊断、预后及治疗靶点等方面。该技术的主要优势在于，能够全面获取多种条件下蛋白质变化的整体图谱。

尽管该方法可为小鼠模型中的阿尔茨海默病研究提供见解，但它也可应用于阿尔茨海默病患者或其他多种疾病患者的组织样本。通常，初次接触该方法的研究者会发现其具有挑战性，因为需要在较短时间内同时处理多个样本。我们最初产生该方法的构想，是源于认识到乙酰化修饰可与等重标签技术结合用于蛋白质硝基化检测，这促使我们致力于使该技术能够全面适用于所有肽段。

本研究将分析阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组的脑、心脏和肝脏组织。取每种组织样本60至90毫克，转移至裂解管中，并加入500微升含8摩尔尿素的PBS溶液。使用机械匀浆器对样本进行匀浆处理。

从裂解管中取出组织匀浆液，并转移至微量离心管中。用100至500微升含8摩尔尿素的PBS冲洗裂解管，将冲洗液与组织匀浆液合并。将组织匀浆液离心15分钟。

收集每个样品的上清液。进行BCA检测以确定蛋白浓度后，从每个样品中取100微克蛋白加入预先标记的微量离心管中。向每个样品中加入二硫苏糖醇。

在37摄氏度下孵育两小时。向每个样品中加入碘乙酰胺（IAM），并在冰上避光孵育两小时。接着，向每个样品中加入L-半胱氨酸，并在室温下孵育30分钟。

30分钟后，加入含氯化钙的Tris缓冲液，将尿素稀释至终浓度为2摩尔。向每个样品中加入经L1对甲苯磺酰氨基苯乙基氯甲基酮处理的胰蛋白酶，并在37摄氏度孵育24小时。

次日，将样品在液氮中快速冷冻以终止蛋白质消化反应，并在负80摄氏度下保存，直至后续处理。在进行二甲基化标记前，按照文本方案所述对肽段样品进行脱盐处理，并通过真空离心干燥。开始二甲基化标记步骤时，用含有1%乙酸的HPLC级或超纯水溶液重新溶解肽段。

取每份样品50微克，转移至新的1.5毫升微量离心管中。将剩余的重组肽在-80°C下保存，用于后续实验。在接下来演示的步骤中，关键是要快速加入试剂，以确保所有样品的化学反应时间保持一致。

向需进行轻度二甲基标记的样品中加入8 µL 60 mM甲醛溶液。向需进行重度二甲基标记的样品中加入8 µL 60 mM碳13氘代标记的甲醛溶液。向进行轻度二甲基标记的样品中加入8 µL 24 mM氰基硼氢化钠溶液。

向标记为重同位素二甲基化的样品中加入8 µL 24 mmol/L的氰基硼氢化钠。涡旋混合样品，然后在室温下轻轻振荡约10分钟。加入16 µL 1%氨水反应5分钟以终止反应。

通过加入八微升5%甲酸使反应混合物重新酸化。合并轻链和重链二甲基化肽段，共生成六个样品。按照文本方案中所述进行样品脱盐。

通过真空离心法干燥样品。为了对二甲基化样品进行同重标记，首先将100微克的二甲基化肽段溶解于三乙基碳酸氢铵（TEAB）缓冲液中。接下来，根据同重标记试剂盒的制造商说明书配制同重标记试剂。

加入适当体积的可溶性等重标记试剂，本例中为每个肽样品加入41 µL，并涡旋约10秒。将样品在室温下于微型离心管振荡器上振荡约1小时。为终止反应，向每个样品中加入8 µL羟胺。

将样品在室温下孵育15分钟。将六个标记的样品合并为一个混合物并进行脱盐。用含有0.1%甲酸的色谱纯水重新溶解肽段，以制备用于液相色谱分析的样品。

将重悬的多肽加入含有0.65微米滤膜的微量离心管中，然后在12,000 × g离心1分钟。移除并弃去滤膜。

将过滤后的肽段转移至自动进样瓶中。将每个强阳离子交换组分样品的六微升注入捕获柱，用十八烷基碳材料填充至两厘米。

运行分析分离和数据采集质谱方法。对阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照的小鼠脑、心脏和肝脏组织进行了12重cPilot分析。前体数据显示出由m/z 643.854和647.875处峰代表的轻链和重链二甲基化肽段。

这些肽段被独立选择、分离，并通过碰撞诱导解离产生上述谱图。搜索结果显示，这些峰归属于磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase one）蛋白的一个肽段。这些峰进一步被分离，进行高能碰撞解离串联质谱分析，其报告离子如图所示。

两组三重串联质谱谱图对于获取12个样本的信息均是必需的。在此示例中，阿尔茨海默病与野生型对照的离子比值在脑、肝和心脏组织的两个生物学重复之间相似。每次比较的倍数变化值表明，阿尔茨海默病小鼠脑和心脏中的磷酸甘油酸激酶1水平较高，而肝脏中的水平较低。

一旦掌握，该技术若操作得当，大约可在五小时内完成。在进行此操作时，务必注意小心处理样品。本操作中可结合强阳离子交换或高 pH 分级等分离方法，以提高每日的检测深度和覆盖范围。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用 C-Pilot 增强样本多重检测能力。