膜蛋白共翻译插入预制纳米盘

该方案高效且用途广泛，几乎适用于任何膜蛋白，整个制备过程可在一天内完成。通过添加配体，合成的膜蛋白在共翻译过程中即可实现稳定化。

完全避免了去污剂的接触，蛋白质可直接在所提供的定制膜环境中插入并正确折叠。该技术主要应用于结构研究、功能表征以及抗体生成。此外，该方法也适用于直接分析脂质对膜蛋白折叠和功能的影响，操作简便。

在培养的第三天，将100毫升预培养物接种至15升搅拌罐反应器中含10升无菌YPTG培养基（37摄氏度）中。在37摄氏度、500转/分钟及高通气条件下培养细菌。为防止过度起泡，加入无菌消泡剂。

当细胞进入对数生长期中期时，向培养物中加入 300 毫升乙醇，并在高通气条件下于 42 摄氏度、500 转/分钟继续孵育 45 分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并使用刮勺和移液器将细胞完全重悬于 300 毫升 S30A 缓冲液中。将重悬的细菌离心两次，每次用 300 毫升新鲜 S30A 缓冲液洗涤沉淀。

第二次洗涤后，将细胞重悬于1.1倍体积的S30B缓冲液中。将悬液加入预冷的法式高压破碎仪压力腔中，在1,000 psi（磅/平方英寸表压）条件下破碎细胞一次。为去除不稳定的组分并使mRNA从核糖体上释放，将裂解液调节至0.4摩尔氯化钠浓度，并在42°C水浴中孵育45分钟。

为组装膜支架蛋白纳米盘，将MSP1E3D1溶液与脂质溶液混合，并加入DPC至终浓度为0.1%。根据表格调整反应至适当的终体积，在21摄氏度下轻轻振荡孵育反应1小时。孵育结束后，用纳米盘形成缓冲液预先润湿透析盒的膜，并用注射器将组装混合物加载至透析盒中。随后，在室温下搅拌条件下，用三份五升的纳米盘形成缓冲液对反应液进行透析，每次10至20小时，然后将混合物转移至已用纳米盘形成缓冲液平衡、截留分子量为10千道尔顿的离心过滤装置中。

然后通过离心浓缩反应液至至少 300 微摩尔，使用紫外-可见分光光度计测量浓度。为制备 3 毫升连续置换无细胞反应体系，先将 3 毫升透析盒的膜在 100 毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷-乙酸盐缓冲液中平衡，再用注射器将反应混合物转移至透析盒中。

使用注射器从反应混合物室中除去多余的空气，并将盒体放入透析室中。向透析室内加入60毫升喂养混合物，并盖上盖子。固定好盖子后，将透析室置于30摄氏度、200转/分钟的条件下孵育12至16小时。

为进行镁离子筛选，准备一个60微升的细胞交换无细胞反应体系：将60微升新鲜配制的3倍浓度主混合液加入反应混合物中，825微升加入喂养混合物中，并用去离子水补足喂养混合物的体积。涡旋混匀后，取825微升喂养混合物分别加入24孔微孔板的三个孔中。

将截留分子量为10至14千道尔顿的再生纤维素透析管切成约25毫米×20毫米大小的片状，并将这些片状物储存于添加了0.05%叠氮化钠的水中。在进行微型细胞无细胞反应体系组装前，用纸巾去除透析膜表面多余的水分，然后将一片透析膜放置在每个反应容器上。用聚四氟乙烯环固定透析膜，并将微型反应容器转移至含有喂养混合液的孔中。

按照表格中的指示，将高分子组分加入反应混合物中，并用移液器混匀。取60微升反应混合物加入反应容器中，注意避免产生气泡。将两张8厘米×10厘米的密封热塑性薄膜包裹在24孔板上。

用胶带将孔板的盖子固定，然后将孔板置于30摄氏度、200转/分钟并持续振荡的条件下反应12至16小时。次日早晨，使用移液器吸头刺穿微型透析交换无细胞反应容器中的透析膜，吸取反应混合物。将反应混合物转移至新的离心管中，并进行离心以去除沉淀物。

然后将上清液转移至新管中。此处展示了微调反应组分对合成膜蛋白最终产量或质量的代表性影响。在此分析中，T-β1 肾上腺素受体的总体合成及纳米盘增溶效果在所有分析的膜组成条件下均相似。

相比之下，合成的G蛋白偶联受体的质量表现出更大的差异，其中使用DMPC和POPC脂质时活性最低，而使用DOPG和POPG时活性最高。综上所述，这些结果表明脂质头部基团的电荷以及脂肪酸链的柔性是该细胞膜蛋白折叠和活性的重要调节因素。最终纳米盘的浓度也可能是影响膜蛋白质量的重要因素。

例如，如果在 3.75 至 60 微摩尔范围内筛选纳米盘的浓度，则在约 30 微摩尔纳米盘条件下可实现 G 蛋白偶联受体的完全增溶，此时膜蛋白与纳米盘的比例为 1:3。相比之下，约 10 微摩尔的纳米盘即可实现紫菌视紫红质的完全增溶，此时紫菌视紫红质与纳米盘的比例为 10:1。精确的移液操作和高质量的组分是必不可少的。

裂解液制备的关键步骤包括在对数生长中期收获细胞以及应用高盐步骤。该技术显著降低了膜蛋白合成的复杂性。以往难以实现的靶标现在可被高效合成，从而使得研究人员能够开展针对迄今尚未探索的具有药物相关性蛋白的分子结构研究。