通过珠粒上Galectin-3与U1 snRNP复合物对剪接活性的互补作用

本报告提供了实验依据，证明半乳糖凝集素-3（galectin-3）与U1 snRNP形成的复合物能够结合前体mRNA底物，构成具有功能的复合体，并产生剪接反应的产物。本方案利用固定在磁珠上的抗galectin-3抗体共价偶联后免疫筛选出galectin-3 U1 snRNP复合物，以此启动剪接反应，并可使反应进行至完成。该方案的关键步骤在于：在沉淀含有galectin-3 U1 snRNP复合物的磁珠后，需仔细去除上清液，并立即用于启动剪接反应。

为了从核提取物中去除U1 snRNP，将200微升核提取物与100微升抗U1磁珠孵育。向混合物中加入5微升RNA，在4摄氏度下将微量离心管头尾旋转孵育1小时。通过离心收集沉淀物，并使用汉密尔顿注射器收集未结合的组分。

将U1耗竭的核提取物的全部体积与另一份50微升未耗竭的原始核提取物分别置于微型透析器的不同隔室中，在4°C条件下，用60%缓冲液D透析75分钟，并持续搅拌。使用截留分子量为8K的透析膜。透析完成后立即将其分成每份20微升的等分试样，然后在干冰乙醇浴中快速冷冻，并于-80°C保存。

使用前，用 0.5 毫升 TX 洗涤缓冲液将抗 gal3 磁珠洗涤两次。每次洗涤时，加入洗涤缓冲液后离心，先用移液器吸除上清液，再用 Hamilton 注射器将液体从磁珠中彻底移除。

将核提取物在12%至32%的甘油梯度中进行分级分离。收集并混合靠近10S区域的甘油梯度组分三、四和五。取两份各150微升的第三至第五组分混合液，分别加入50微升抗gal3珠中。

同时，取两份样品，每份加入150 µL的第一组分，并分别加入50 µL抗gal3珠中。作为对照，将150 µL 60%缓冲液D加入50 µL抗gal3珠中。轻轻敲击管壁混匀，然后在4°C下以头尾翻转的方式旋转孵育1小时。

使用低速离心沉淀样品。用微量移液器移除大部分上清液。使用Hamilton注射器，将针尖小心插入磁珠底部，彻底去除上清液。

立即使用磁珠进行剪接反应。按照文稿中所述组装剪接反应体系，并将其加入其中一组磁珠样品中。在总体积为24 µL的条件下组装另一组相同的剪接反应体系，但不加入U1耗竭的核提取物，并将其加入另一组磁珠中。

准备一个剪接对照反应，在无任何珠粒的情况下进行，总体积为12微升。该对照反应包含核提取物、60%缓冲液D和放射性标记的剪接底物。轻轻弹击离心管混匀，于30°C旋转（头尾颠倒）孵育90分钟，然后通过轻柔离心沉淀反应混合物。

通过向含有珠子的离心管中加入24微升2×SDS上样缓冲液，以及向不含珠子但含有核提取物的对照管中加入12微升2×SDS上样缓冲液，终止反应并洗脱珠子上的蛋白质。涡旋振荡各管。将各管在100摄氏度下加热七分钟。

将离心管在室温下以1,000 × g的转速在摆桶转子中离心10至15秒。将上清液转移至新的微量离心管中。加入20毫克/毫升的蛋白酶K以消化并溶解蛋白质。

将试管在37摄氏度下孵育40分钟。孵育结束后，轻轻离心试管。用39.5微升TE缓冲液和10微升3摩尔醋酸钠稀释珠子洗脱液。

将核提取物对照用 63.5 微升 TE 和 10 微升醋酸钠稀释。按照文本稿件中所述方法提取并分析 RNA。将通过抗 gal3 抗体免疫沉淀甘油梯度 10S 区域获得的、去除了 U1 snRNP 和 gal3 U1 snRNP 复合物的核提取物混合，用于剪接反应。

该反应混合物含有U1 snRNA以及U1特异性蛋白U1-70K。正如预期，抗gal3抗体沉淀了gal3。在前免疫对照沉淀中未检测到U1 snRNA、U1-70K蛋白和gal3。

与作为阳性对照的非耗竭型核提取物相比，耗竭了U1 snRNP的核提取物未表现出剪接活性。在U1耗竭的核提取物中，剪接活性可通过珠粒结合的gal3 U1 snRNP复合物恢复。剪接反应的两种产物——连接的外显子和切除的内含子套索，以及反应中间体均被检测到。

第三至第五组分在恢复U1耗竭核提取物的剪接活性中起关键作用。当这些组分仅被缓冲液替代时，无法观察到任何剪接活性，这表明抗-gal3珠子本身并非导致U1耗竭核提取物中剪接活性恢复的原因。更有说服力的是，当在免疫沉淀过程中用第一组分替代第三至第五组分，再将其加入U1耗竭的核提取物时，未检测到任何剪接反应的中间产物或终产物。在执行该实验方案时，应由一人完成免疫沉淀操作，同时另一人尽可能快速地准备剪接反应，以减少延迟。

对能够恢复U1耗竭核提取物剪接活性的半乳糖凝集素-3 U1 SNRP的多肽组成进行蛋白质组学分析将具有重要意义。