快速制备用于时间分辨冷冻电镜的载网

您好，欢迎观看本期 JoVE 视频。我们将向您介绍我们在利兹开发的快速网格制备装置，这是一种用于时间分辨研究的实验系统。请注意，这并非标准配置，但我们希望通过详细阐述我们所使用的各项设备和参数，帮助您在各自的实验室中构建类似的系统。

该设备的详细描述见于Richmond方案。本文将提供快速网格制备和时间分辨电镜观察的逐步操作指南。根据我们的经验，蛋白质浓度应为每毫升2毫克或更高。该方案所需最小体积约为50微升。

打开设备。然后开启控制计算机并启动控制软件。通过按下每个注射泵上的初始化按钮，对所有注射泵进行初始化。

打开电位计电源，将其调至9伏，并启动示波器控制软件。需要加压氮气以产生喷雾。打开氮气瓶，将压力设为2 bar。

确保所有注射泵的阀门均处于加载位置。为此，请在控制软件中先将所有阀门切换至排液状态，然后再切换回加载状态。将所有注射器归零。

此时应除去系统中存在的任何气泡。为此，可能需要将注射器卸下，手动去除气泡，并在确认无残留气泡后重新安装注射器。液体处理系统通常保存在水中。

在上样前，需用缓冲液对系统进行平衡。通过用过量缓冲液冲洗管路来实现。将含有至少 200 微升缓冲液的管子插入第一支注射器。

必须刺穿管子的顶部以进行连接。使用控制软件，用1号注射器吸取适量缓冲液，体积介于50至100微升之间。切换1号阀门以进行分配。

将第一个注射器中的所有液体排出。将第一个阀门转回加载位置，然后按下第一个注射器上的初始化按钮，以使系统准备好进行下一个清洗循环。这些步骤通常重复三次，以确保管路得到彻底清洗。

接下来，定位喷雾喷嘴。将一块EM载网放入冷冻夹持臂中。将载网置于喷雾喷嘴前方。

使用控制软件分配缓冲液。如果喷嘴与网格对齐，喷射较长时间后液体应在网格上积聚。如有必要，调整喷嘴位置，然后再次检查液体在网格上的积聚位置。

接下来，调整乙烷杯的位置。镊子的尖端应大致到达乙烷杯的中心位置。进行一次试运行，以确保所有设置正确无误。

关闭湿度室。确保推杆的运动路径畅通无阻。将单次运行所需的缓冲液体积吸入第一支注射器中。

将阀门一切换至分配状态。在控制软件中按下“运行”以开始实验。检查第一台注射泵是否开始移动（本例中为2秒），并在适当的延迟后（此处为1.5秒）将载网浸入。

当运行结束后，将推杆臂的压力调节至所需数值。在控制软件中按“OK”以释放推杆臂的压力。此时乙烷杯已冷却并充满液态乙烷。

使用前对载网进行辉光放电处理。典型的辉光放电条件为在0.1毫巴空气下以10毫安电流处理90秒。随后用样品对管道进行平衡。

如果可用的样品体积较少，可仅用一个死体积的溶液对管路进行平衡。吸取样品。通常死体积约为 30 µL。

将阀门一切换至分配模式。通过管路和喷嘴分配样品。然后吸取单次运行所需的样品量。

将阀门一切换至分配状态。检查相对湿度是否已达到所需值。我们通常在60%或更高的湿度条件下制备载网。

这可能需要几分钟。将夹持着辉光放电处理过的载网的镊子放入冷冻投入装置的机械臂中。将电位器滑块置于起始位置，准备进行速度测量。

在示波器软件中设置速度测量的触发条件。放置液态乙烷杯，并将其靠近湿度室。确保推杆的运动路径畅通无阻。

在控制软件中启动运行。运行结束后，在控制软件中按“OK”以释放压入臂的压力。打开湿度室，松开压入臂与镊子之间的连接。

在保持载网处于液态乙烷中的同时，上移骤冷臂。随后将载网转移至液氮中进行储存。保存示波器的测量结果。

手动重置电位器滑块和柱塞的位置。重复该方案以制备重复样品载网。时间分辨实验以类似方式进行。

由于混合步骤中的稀释作用，时间分辨实验需要更高的储备液浓度。进行时间分辨实验时，需使用全部三个注射器。将管路连接至注射泵和喷雾喷嘴。

此处使用的微流控喷嘴还包含一个混合元件。请注意，较长的管路会导致更大的死体积，且清洗平衡步骤需要更多的缓冲液和样品。将所有注射器分别用缓冲液和样品进行平衡。

通常，注射器一用于样品A，注射器二和三用于样品B。在管路平衡后，将样品A装入注射器一，将样品B装入注射器二和三。然后，切换阀门一至三以进行 dispensing（分配）。在控制软件中启动运行。

请注意，时间分辨实验需要使用不同的运行脚本。可通过两种方式实现不同的时间延迟。通过调节推进器速度，可以改变从混合到冷冻的时间延迟。

更快的 plunge 速度将导致更短的时间延迟。或者，可通过调节喷嘴的垂直位置来改变喷射乙烷的距离。增加距离将导致更长的时间延迟。

在低倍电子显微镜下，典型的载网图像如下所示。如图所示，薄冰区域适合进行数据采集。在更高倍数下，颗粒应清晰可见。

对于载铁蛋白脱辅基蛋白等测试样品，仅需从单个载网获取的相对较小的数据集，即可实现三到四埃分辨率的重构。对于时间分辨实验，我们从不同的时间点或载网收集数据集。将数据合并用于三维分类，然后将颗粒追溯至其对应的时间点，这种方法非常有用。

通过这种方法，数据可提供结构信息以及反应动力学信息。总之，希望您喜欢本视频。我们希望，结合 JoVE 论文中的详细描述和视频内容，您将能够通过快速网格制备技术开展自己的实验，该方法已被证明可缓解由突变引起的一些问题，或有助于在气-水界面处的相互作用，为您开展自主的时间分辨研究提供所需条件，以尝试捕获那些非平衡态。

那么，祝您愉快地制作表格。