使用200 kV透射电子显微镜常规采集高分辨率冷冻电镜数据集
2022年3月16日
使用200 kV透射电子显微镜（TEM）也可获得大分子的高分辨率冷冻电镜图谱。本方案介绍了实现精确光学对中、数据采集策略以及成像区域选择的最佳实践，这些步骤对于利用200 kV TEM成功获取高分辨率数据集至关重要。
冷冻电镜（Cryo-EM）已成为测定蛋白质及其复合物结构的标准技术。本方案描述了如何利用中等范围的200 kV透射电子显微镜（TEM）获得高分辨率Cryo-EM数据集的最佳实践。Cryo-EM能够在接近天然溶液条件下，同时解析多种构象状态和功能状态的蛋白质结构，这是其他结构生物学技术难以实现的。
获得的结构信息可用于阐明蛋白质功能的分子机制，也可用于基于结构的药物设计。例如，近期一篇关于淀粉样纤维结构的研究论文揭示了一种重要配体的多个结合位点。然而，在本实验方案中，我们采用脱铁铁蛋白和蛋白酶体的标准样品，以演示获取高分辨率冷冻电镜数据的关键步骤。
近年来，冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）的操作已变得更加简便，尤其是由于引入了先进的自动化功能。然而，在首次使用时，我们建议您接受经验更丰富的用户进行培训。在此基础上，该技术的掌握进程将相对较快。
演示该实验操作的是赛默飞世尔科技公司的高级应用科学家 Adrian Koh。在液氮条件下，将自动网格插入自动装载盒中。将装有自动网格的装载盒插入经液氮冷却的转移胶囊内。
将样品舱进一步插入显微镜，然后在显微镜用户界面中点击“Dock”按钮，将样品舱中的样品盒载入显微镜的自动进样器中。点击“Inventory”按钮以检查已加载样品盒中自动载网的存在情况。随后点击“Load”和“Unload”按钮，将自动载网插入透射电镜成像用的镜筒中。
选择图谱选项卡，然后点击“新建会话”按钮以打开一个新会话。填写会话名称和数据存储位置等详细信息，然后点击“应用”按钮。通过勾选相应网格编号旁边的复选框，选择感兴趣的网格。
单击“开始”按钮，以全自动方式收集所有选定网格的图谱集。当采集完成后，单击网格标签以查看获取的图谱集。选择 EPU 选项卡，然后在左侧面板中进入“新建会话”以创建新会话。
选择“新建会话”选项以使用当前的光学预设设置。填写会话名称。选择会话的手动类型，以便在后续实验流程中手动控制用于数据采集的单个孔和网格区域的选择。
选择更快的采集模式，以使用无像差的图像偏移进行数据采集。然后输入保存元数据的位置。单击“应用”按钮以创建新会话。
在左侧面板中选择方形选择任务，以显示采集到的网格图谱。识别具有完整支撑膜、无损伤、薄玻璃态冰和膜孔、网格方格内结晶冰污染可忽略不计且网格方格及单个膜孔内亮度梯度最小的网格方格。在完整图谱或高质量 tile 图像中选择用于数据采集的网格方格。
右键单击感兴趣的网格方格，选择整体选中任务。单击自动对中按钮，自动移动至第一个选定的网格方格。调整对中高度，并获取网格方格图像以寻找载网孔。
单击“查找孔洞”按钮以在图像中查找箔片上的孔洞。单击“移除孔洞”按钮并关闭网格条按钮，以取消选择靠近网格条的孔洞。调整冰过滤器亮度直方图中的阈值范围，以剔除冰层过厚以及完全空的孔洞。
在网格方格图像中的孔位上单击右键，选择“移动载物台至位置”→“在此处移动载物台”。在左侧面板中选择模板定义任务。单击“采集”按钮以获取整幅图像。
将图像偏移后的延迟时间设置为0.5秒，将台面偏移后的延迟时间设置为5秒。点击“查找并居中孔洞”按钮，使图像中的孔洞居中。选择“添加采集区域”按钮，并在图像上点击已居中孔洞中的位置，以确定高倍成像采集的位置。
单击“添加自动对焦区域”按钮，然后在图像上点击选择位于中心孔附近支撑膜上的位置，以进行图像自动对焦。单击绿色的“采集区域”以在软件窗口顶部区域的离焦列表中设置一系列离焦值。完成自动对焦相关参数设置后，选择“居中后”选项，以便在每个AFIS簇开始时自动执行对焦。
选择“物镜”选项以实现更快的自动对焦并减少载物台漂移。在孔选择任务中，单击“准备所有方格”按钮，系统将根据此第一个网格方格中设置的参数，自动配置数据采集及其他所有选定的网格方格。选择模板定义任务，采集一幅新图像，通过右键单击将载物台移动至碳膜上的洁净区域，并选择菜单选项“将载物台移至此处”。
选择“自动功能”选项卡。在设置所需的离焦量并进行迭代后，切换到自动聚焦预设，然后单击“开始”按钮以运行自动聚焦功能。选择“自动消像散”任务，切换到“Thon环”预设，然后按下“开始”按钮。
选择 Autocoma 任务并按下开始按钮。将载物台移动至网格方格断裂的区域。通过拍摄一张自动对焦图像来确认该区域的透光性。
打开 Sherpa 用户界面，选择能量滤波应用。点击 Center 按钮和零损失选项，以居中零损失能量滤波狭缝。在等色性选项中点击 Tune 按钮。
单击几何畸变和色差畸变中的“调节放大倍数和调节畸变”选项。转到 EPU 选项卡，选择自动采集任务，然后单击“开始运行”按钮以启动全自动数据采集。该图显示了冷冻电镜载网，其表面冰层厚度呈梯度变化。
被排除在进一步研究之外的载网包括冰层过厚的劣质载网，以及存在弯曲、冰层质量差且被污染的载网；而符合要求的载网则是具有理想冰层梯度的载网，以及具有均匀薄冰层和较小冰层梯度的典型载网。该图展示了重建的脱铁铁蛋白冷冻电镜三维结构图。由于其高度的稳定性和对称性，脱铁铁蛋白成为高分辨率冷冻电镜成像与图像处理的理想基准样品。
贝叶斯精修、CTF 精修以及埃瓦尔德球校正获得了分辨率为 1.63 埃的三维重构图。该图展示了去辅基铁蛋白冷冻电镜图在单个氨基酸侧链水平上的详细视图。氨基酸侧链的密度清晰可辨，原子模型可在图中明确构建。
此处图像显示了从同一块冷冻电镜载网、相似的载网方格区域采集的两组不同离焦值下的数据集，其中一组使用全开狭缝，另一组使用10电子伏特狭缝，结果表明10电子伏特狭缝显著提高了图像对比度。下图展示了作为标准冷冻电镜样品的20S蛋白酶体冷冻电镜图谱的总体结构，以及其分割后的亚基。放大视图中叠加了拟合的原子模型，代表具有D7对称性的蛋白酶体复合物的稳定催化核心。
该方案包含两个关键步骤：一是寻找含有均匀颗粒且玻璃态冰较薄的区域；二是设置平行照明以进行数据采集。
随着蛋白质的高分辨率重构已达到两到三埃的分辨率，人们能够更深入地理解疾病的分子机制，并优化药物研发的先导化合物。过去，若要研究生物现象的结构基础，必须进行结晶。而如今借助冷冻电镜（Cryo-EM），这一限制已不复存在。
因此，通过冷冻电镜技术，我们使科学家能够在结构层面上研究更广泛的生物现象。
概述
本方案概述了使用200 kV透射电子显微镜获取高分辨率冷冻电镜数据集的最佳实践。重点包括精确的光学系统校准、数据采集策略以及成像区域的选择。
关键研究组成部分
科学领域
- 冷冻电子显微镜
- 结构生物学
背景
- 冷冻电镜（Cryo-EM）是测定蛋白质结构的常规技术。
- 该技术可实现对蛋白质在接近天然状态下的研究。
- 此方法能够同时捕获多种构象状态和功能状态。
- 近年来的技术进步使得冷冻透射电镜（Cryo-TEM）的操作更加简便。
研究目的
- 展示获取高分辨率冷冻电镜数据的关键步骤。
- 提供使用脱铁铁蛋白和蛋白酶体等标准样品的实验方案。
- 通过详细的结构信息促进基于结构的药物设计。
使用的方法
- 使用自动网格和液氮条件进行样品制备。
- 从选定的网格自动采集图谱。
- 手动选择网格方格以进行数据采集。
- 利用先进的自动化功能实现高效数据采集。
主要结果
- 成功从 200 kV 透射电子显微镜获取高分辨率数据集。
- 确定用于成像的最佳载网方格。
- 展示自动化与手动数据采集技术的操作方法。
- 建立适用于未来研究的可靠实验方案。
结论
- 该方案为获取高分辨率冷冻电镜（Cryo-EM）数据提供了全面的指导。
- 建议初学者在有经验的用户指导下进行培训。
- 自动化技术的进步提高了冷冻电镜操作的效率。
常见问题
行业重要性概述
采用200 kV透射电子显微镜（TEM）系统的高分辨率冷冻电镜技术，能够常规性地解析蛋白质的原子级结构，使该技术的应用不再局限于专用的300 kV平台。自动化操作与实时质量评估简化了数据采集流程，有助于在药物发现早期快速、可重复地获得结构信息。该能力显著增强了生物制药研发管线中靶点验证与先导化合物识别关键节点的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 有助于阐明蛋白质功能及疾病相关性的分子机制。
- 通过提供原子分辨率的靶标结构图谱，支持基于结构的药物设计。
- 通过直接可视化构象状态和结合状态，促进功能靶标的验证。
- 减少对结晶的依赖，拓展可研究靶标的范围。
筛选与检测方法开发
- 为下游筛选和检测开发工作流程提供经过验证的结构模板。
- 标准化成像参数和数据质量，确保实验间具有可重复性。
- 实现对配体结合和构象变化的定量评估。
- 支持可扩展、自动化的数据采集，用于高通量结构筛选。
转化与临床前研究
- 将结构输出与疾病相关模型对齐，以推动转化生物标志物的开发。
- 通过实现机制性风险降低，提供从发现到临床前验证的连续性。
- 通过明确结构-功能关系，优化经风险调整的推进决策。
流程与工作流整合
该方案将200 kV冷冻电镜技术确立为从早期发现到临床前研究的核心能力，贯穿靶点验证、先导物识别及作用机制去风险化等环节。
- 发现生物学：通过解析接近天然状态的蛋白质结构，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复、定量的结构数据，用于化合物评估和检测准备。
- 分析：实现对结构状态和配体相互作用的高分辨率测量及统计学比较。
- 转化研究：将原子水平的洞察与疾病模型及生物标志物策略相连接。
- 企业级复用：建立标准化、自动化的实验流程，可适用于多种蛋白质靶标和研究项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：通过自动化和实时质量控制，增强标准化、可重复性和通量。
- 战略价值：支持更明智的立项/终止决策，实现资本高效的项目组合管理。
- 项目组合影响：支持对结构验证靶点进行风险调整后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备冷冻电镜操作和数据分析的专业知识，建议接受初步培训。
- 需要使用配备能量过滤器和直接电子探测器的200 kV透射电子显微镜系统。
- 高通量工作流程需要强大的数据管理和质量评估基础设施。
- 成像参数和自动化流程的标准化对于跨团队可重复性至关重要。
- 针对特定蛋白质靶标的适应可能需要优化样品制备和成像条件。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:27
Grid Loading, Mapping, and Selection of Best Cryo-EM Grids for Data Collection
2:36
Setting up a Data Collection Session in the Single Particle Analysis Software
5:44
Final Microscope Alignments Before Starting Data Collection
7:15
Results: Gallery of Grids, Cryo-EM Reconstruction of Apo-Ferritin, and Effect of Energy Filtering on Cryo-EM Images
8:56
Conclusion
