探索病毒感染期间的 m⁶A 和 m⁵C 表观转录组：以 HIV 为例

您好，在本视频中，我们将向您展示如何在病毒感染后研究 m6A 和 m5C 表观转录组。实验开始时，您需要准备 5000 万个未感染的细胞和 5000 万个感染的细胞。为了在分析后获得高质量的数据集，您需要实现全面的感染。

在此，我们用基于HIV的载体感染这些细胞，并通过FACS检测病毒编码的GFP。在此情况下，我们获得了80%的感染细胞，并开始进行后续流程，首先提取总RNA。因此，我们将细胞分成每份1000万个细胞的等分试样，每份加入1 mL Trizol进行裂解。

然后向细胞裂解液中加入 200 µL 氯仿，通过倒置混匀。此时，将裂解液在室温下静置 3 分钟，随后将所有样品在 4 °C 下高速离心 15 分钟。此时应观察到分为三层的不同相，如图所示。

RNA位于上层水相中，因此需小心地将水相转移至新的离心管中，注意避免转移有机相。随后向水相中加入0.5 mL异丙醇，并通过轻柔颠倒充分混匀。样品可在80°C孵育1小时，以确保RNA充分沉淀。

高速离心后，应能看到清晰的RNA沉淀，如图所示。通过倒置或移液小心弃去上清液，注意不要扰动沉淀。随后用1 mL 75%分子生物学级乙醇洗涤RNA沉淀。

然后短暂涡旋混匀样品。离心后，确保获得一个完整的白色RNA沉淀。弃去上清液，将RNA沉淀在室温下干燥15分钟。

将每个沉淀重悬于20 µL水中，并将相同条件下的所有样品合并在一起。总RNA现在可用于通过poly-A选择进行mRNA分离。对于每75 µg RNA的样品，准备200 µL寡核苷酸-dT磁珠，并用1 mL结合缓冲液洗涤磁珠。

将试管置于磁力架上，使磁珠在一次混匀过程中结合至磁铁。弃去上清液，并重复该步骤进行第二次洗涤。随后将磁珠从磁力架上取下，小心地重悬于100微升结合缓冲液中。

此时，通过将RNA样品分装，每份含有75微克RNA，并重悬于100微升水中，以制备RNA样品。加入100微升结合缓冲液，在65摄氏度孵育2分钟。然后离心样品，并置于冰上孵育。

随后，向每个RNA样本中加入100 µL洗涤后的磁珠，于室温下在旋转仪上孵育15分钟，使RNA与磁珠结合。孵育结束后，将离心管放回磁力架上，静置1分钟。然后将上清液转移至新的离心管中，留作第二轮分离使用。

用 200 微升洗涤缓冲液将磁珠洗涤两次，然后进行洗脱。为从磁珠上洗脱 poly-A 选择的 RNA，向每个样品中加入 20 微升冰上预冷的 TRIS HCl，并小心吹打。随后将样品在 80 摄氏度孵育 2 分钟，以释放 RNA。

将含有经多聚腺苷酸选择的RNA的上清液转移至新的离心管中，注意避免磁珠的污染。为了提高mRNA得率，洗脱步骤以及分离步骤均应重复两次。此时mRNA已准备好，可直接进入meRIP-Seq流程的片段化步骤，或直接进行亚硫酸氢盐转化。

进入meRIP-Seq流程的第一步是mRNA片段化。为此，您需要将五微克mRNA分装至0.2 mL离心管中，每管18微升。为了确保数据的一致性，操作时必须迅速，并且每次仅处理少量样品。

本实验中，已对片段化条件进行优化，以获得长度在115至200个核苷酸之间的片段。然后向每个含有18 µL mRNA的离心管中加入2 µL片段化试剂，注意将液滴加在管壁上。将所有样品短暂离心，使试剂与RNA同时接触，并在70°C下孵育15分钟。

孵育结束后，加入 2 µL 0.5 M EDTA 以终止反应。此时，可使用您选择的方法纯化片段化的 mRNA，并通过片段分析仪进行 RNA 质量控制。此步骤为可选步骤，但可在进行 RNA 沉淀前评估片段的大小。

如您在此处第四泳道所见，我们获得的两个样本片段大小均约为150个核苷酸。随后我们进行了meRIP-Seq实验。第一步是将A/G磁珠与抗m6A抗体或IgG对照分别偶联。

针对每个反应方案，将25 µL磁珠转移至新的离心管中。请注意，您至少需要设置一个m6A特异性条件和一个对照条件。用250 µL IP缓冲液洗涤每份25 µL磁珠。

用移液器轻轻吹打重悬磁珠，将离心管置于磁力架上静置1分钟，使磁珠充分分离。小心移除并弃去上清液，注意不要吸到磁珠，重复洗涤步骤一次。随后，每25微升原始磁珠体积加入100微升免疫沉淀缓冲液（IP buffer），重悬磁珠。

为每种条件准备并标记一个离心管。在本实验中，感染组需要两个离心管，分别用于m6A和IgG对照，未感染组也需要两个离心管。然后向每个离心管中加入100 µL洗涤后的磁珠。

磁珠现已准备好与特异性抗体或IgG对照偶联。向每管含有100 µL洗涤后磁珠的溶液中加入5 µg的特异性抗m6A抗体或抗IgG对照抗体。将各管置于旋转仪上孵育30分钟，使抗体与磁珠结合。

同时，进行样品制备。针对每个预设条件（m6A特异性或IgG对照），起始材料为2.5 µg重悬于100 µL水中的片段化mRNA。为达到500 µL的终反应体积，向每个样品中加入295 µL水。

加入5微升浓度为40单位/微升的RNase抑制剂，使每份样品总量达到200单位，轻轻混匀。最后向每根试管中加入100微升5倍浓缩的IP缓冲液。样品现可进行免疫沉淀反应。

从旋转轮上取出与抗体偶联的磁珠，并进行离心沉淀。将500微升预先制备的样品加入到每100微升与特异性抗体偶联的磁珠中。用移液器轻轻吹打数次，充分重悬磁珠。

将样品或meRIP反应液置于4°C的旋转摇床上孵育两小时。孵育结束后，短暂离心各管，然后将其置于磁力架上静置一分钟，使磁珠充分分离。随后移除未结合的上清部分，转移至新的离心管中，如需要可保存用于后续分析。

从磁力架上取下磁铁，将所有样品重悬于500 µL免疫沉淀缓冲液中。通过上下吹打小心地重悬每个样品。将磁铁插入磁力架，孵育1分钟，然后小心地移除上清液。

重复洗涤两次，然后进行洗脱。每对样品（m6A特异性样品和对照样品）准备225微升洗脱缓冲液，其中含有20毫摩尔的纯化m6A。然后每份样品加入100微升洗脱缓冲液。

将所有样品在4°C条件下于摇床上孵育一小时。然后将富集的m6A RNA样品收集至新的离心管中，并进行第二轮洗脱。使用您选择的方法纯化m6A富集的RNA，此时样品已准备好进行文库构建和测序。

为了研究m5C修饰，我们采用亚硫酸氢盐转化法。实验起始使用500纳克的poly-A尾化RNA。尽管为可选步骤，向样品中添加500皮克的poly-A耗竭RNA以确保核糖体RNA的代表性，以及0.5微升市售的合成序列，可在测序后用于评估亚硫酸氢盐转化效率。

将样品用水调整至终体积为 20 µL，然后向每个样品中加入 130 µL RNA 转化试剂。通过移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心所有样品，确保管壁上无液滴残留。将所有样品置于 PCR 仪中孵育，进行三个循环：70 °C 变性 5 分钟，54 °C 亚硫酸氢盐转化 45 分钟。

通过在空柱中直接加入250微升RNA结合缓冲液和150微升的亚硫酸氢盐转化样本，进行柱上脱氨反应。用移液器反复吹打混合样本，注意不要触碰到柱子的滤膜。将400微升95-100%乙醇直接加入柱中的RNA结合缓冲液混合物中。

盖上盖子并立即倒置混匀。将样品离心30秒，弃去流出液。用洗涤缓冲液洗涤柱子，然后向每个柱子的中心加入200 µL脱磺酸化溶液。

将所有样品在室温下孵育30分钟。将样品以30秒离心，随后进行两轮洗涤。向每个样品中加入400 µL洗涤缓冲液，以最高速度离心30秒，弃去流出液。

将柱子放入新的空离心管中，并用 20 µL 水洗脱亚硫酸氢盐转化后的 RNA。通过 RT-qPCR 检测亚硫酸氢盐转化效率，然后进行文库构建和测序。经过生物信息学分析后，以下是使用该工作流程可能获得的一些结果示例。

在此，我们比较了感染HIV的细胞与未感染细胞在感染后24小时的表观转录组。在A图中，您可以观察到我们对m6A表观转录组进行分析所获得的结果。

在此图中，我们绘制了通过 meRIP-Seq 分析获得的 m6A 富集序列读数。可以清晰地看到，一个锌指结构在感染后 24 小时出现高甲基化。我们在面板 B 中对 m5C 表观转录组研究进行了相同类型的分析。在此图中，每个未甲基化的胞嘧啶以红色显示，而已发生 m5C 甲基化的胞嘧啶比例以蓝色显示。

如您所见，PHLPP1 基因在 HIV 感染后 24 小时，其三个胞嘧啶均呈现高甲基化状态。总体而言，该实验流程可用于研究感染细胞中 M6A 和 m5C 表观转录组，也可直接应用于病毒颗粒。了解病毒感染如何改变宿主的表观转录组景观，将使我们能够揭示一种全新的调控机制。

对病毒感染后差异甲基化转录本的研究将为新的治疗干预提供宝贵的资源。在下方链接中，您可以找到我们关于HIV感染随时间变化过程中差异甲基化转录本研究的开放获取资源。