Ha-CoV-2假病毒在SARS-CoV-2变异株及中和抗体快速定量中的应用

本方案中，我们得出了两项主要发现。首先，我们的Ha-CoV-2平台表明，新出现的Omicron亚型变异株比原始的武汉毒株更具传染性。此外，Omicron亚型变异株对先前毒株诱导产生的中和抗体具有更强的抵抗能力。

SARS-CoV-2 的研究需要 BSL-3 设施，这使得普通实验室难以监测 SARS-CoV-2 变异株并定量中和抗体。我们的 Ha-CoV-2 系统是一种假型病毒，可在普通实验室中使用，能够更快地定量病毒变异株及其对中和抗体的敏感性。Ha-CoV-2 是一种类病毒颗粒，包含 SARS-CoV-2 的所有结构蛋白，并且形态上类似于 SARS-CoV-2。

此外，Ha-CoV-2 使用α型病毒载体以实现高效且快速的基因表达，从而获得快速的结果以及高信噪比，具有良好的可重复性。首先，在T75培养瓶中培养HEK293T细胞，使用含有热灭活胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素的DMEM培养基。进行细胞计数时，将20微升细胞悬液与20微升台盼蓝溶液混合。

向细胞计数室中加入20微升染料混合的细胞悬液，计数每毫升的细胞数量。在10厘米细胞培养培养皿中加入10毫升完全DMEM培养基接种HEK293T细胞。将细胞在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育过夜。

第二天，移除完全培养基，并替换为九毫升无血清 DMEM 培养基。利用病毒颗粒组装所需的指定化合物，制备共转染混合物。将该混合物缓慢加入培养皿中，在 37 摄氏度下孵育六小时。

孵育后，将无血清DMEM更换为完全DMEM培养基，继续共转染孵育长达48小时。然后通过反复吹打单层细胞表面使细胞脱落，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中。在400 ×g离心5分钟。

收集上清液，并通过0.22微米滤器过滤。将含有Ha-CoV-2假病毒的滤液在-80摄氏度下保存。首先，在T75培养瓶中使用含有热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基维持HEK293T ACE2/TMPRSS2细胞。

进行细胞计数时，取20微升细胞悬液与20微升台盼蓝溶液混合。将20微升染色后的细胞悬液加入细胞计数板中，计算每毫升的细胞数量。在96孔板的每个孔中加入50微升完全DMEM培养基，接种2.5 × 10⁴个HEK293T ACE2/TMPRSS2细胞。

将细胞置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育过夜。次日，将50微升DMEM更换为50微升病毒悬液，并在37摄氏度下继续孵育18小时。孵育结束后，向每孔中加入7.5微升细胞裂解缓冲液，在摇床上混匀2分钟。

细胞裂解后，加入新配制的萤光素酶检测试剂，并在旋转摇床上混匀1分钟。使用商用萤光素酶微孔板检测仪分析萤光素酶活性。对于中和抗体检测，将HEK293T细胞接种于50微升完全DMEM培养基中，操作如前所述。

在96孔板中，加入8微升27 BV中和抗体，并用6微升无血清DMEM进行系列稀释。向系列稀释的抗体中加入54微升Ha-CoV2病毒颗粒，混匀悬浮液。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。

然后向含有 HEK293T 细胞的孔中加入 50 微升病毒悬液。作为对照，向仅含有 HEK293T 细胞的孔中加入 50 微升完全 DMEM 培养基。将培养板置于 37 摄氏度的培养箱中孵育 18 小时。

裂解细胞后，加入新配制的萤光素酶检测试剂，通过轨道振荡混匀一分钟。使用商用萤光素酶酶标仪分析萤光素酶活性。Ha-CoV2 奥密克戎株及其变异株产生的信号比野生型 Ha-CoV2 高出四到十倍，提示其感染性更强。抗体 27 BV 对德尔塔和奥密克戎变异株均表现出中和活性。

27种BV对Omicron的ID50效价约为对野生型和Delta毒株的ID50效价的十分之一。