假病毒作为通过中和试验监测针对SARS-CoV-2体液免疫应答的分子工具

假型病毒是可用于研究宿主与病毒相互作用以及检测血清样本中和活性的分子工具。在我们今天介绍的工作中，将展示一种基于三种质粒生产假型病毒的通用方法。在中和实验中，通常使用Y型病毒，但这类病毒具有高度致病性，无法在生物安全二级（BSL-2）实验室中操作，限制了该系统的大规模应用。

假病毒技术相比活病毒更为安全，可用于研究病原体与宿主之间的相互作用，并检测抗体的中和活性。后续实验将利用假病毒技术，探究特定抗体在疫苗接种后维持免疫应答中的作用。首先，在6孔板中接种1毫升人胚胎肾293T细胞。

加入2毫升完全DMEM培养基。第二天，更换为新鲜的无抗生素培养基，以准备细胞进行转染。为了转染贴壁细胞，首先准备混合液A：将质粒DNA加入100微升Opti-MEM培养基中。

接下来，向100微升Opti-MEM中加入17.5微升聚乙烯亚胺。混合A和B组分的内容物，然后进行孵育。孵育期间，每隔三到四分钟轻轻振荡试管以增强混合效果。

将混合物的全部体积加入含有 HEK 293T 细胞的培养板中。转染后 16 至 20 小时，更换为新鲜的完全 DMEM 培养基。将培养板置于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育，以产生假型病毒。

转染72小时后，将上清液收集至收集管中。在室温下以1600 G离心7分钟。随后通过0.45微米的醋酸纤维素滤膜过滤上清液。

在96孔板的各孔中加入50微升完全DMEM培养基。A行各孔留空。在A行各孔中加入100微升假病毒原液。随后用移液器将A行各孔中的50微升溶液转移至B行。重复此操作至G行，以获得系列稀释液。

从培养有易感性 HEK 293T ACE2 细胞的培养板中移除耗尽的培养基，并用 4 毫升 DPBS 洗涤细胞。随后用 1 毫升含胰蛋白酶-EDTA 的 DPBS 盐溶液消化细胞使其脱离。然后将 50 微升易感细胞悬液加入含有假型病毒的每孔中。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育48小时。向每孔加入100微升荧光素酶试剂。孵育结束后，将每孔内容物转移至黑色96孔板，然后使用酶标仪读取结果。

在96孔板中，向B至H行的第一至第十列每孔加入50微升新鲜的完全DMEM培养基。向A行对应孔中加入95微升新鲜的完全DMEM培养基。向第11列各孔加入50微升完全DMEM培养基，向第12列各孔加入100微升DMEM培养基。用移液器向A行各孔加入5微升热灭活的血清样本。使用多通道移液器混匀第一行样本，然后将含血清的培养基从A行转移50微升至B行，依次转移至H行。向第1至第11列的每个孔中加入50微升含稀释假病毒的培养基。将该板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。

将易感的 HEK 293T ACE2 细胞重悬于 5 毫升培养基中。每孔加入 50 微升细胞悬液，孵育后进行荧光素酶检测。血清稀释度越低，病毒进入细胞的程度越低。

这通过中和作用百分比的增加得到证实。