利用膜片钳技术研究线粒体产热能力

本方案描述了如何利用膜片钳技术通过直接测量线粒体内膜上的质子漏流来研究线粒体的产热能力。直接测定穿过线粒体内膜的质子电流有助于识别并精确表征介导线粒体产热的分子机制。该技术不仅可用于测量线粒体内膜上的质子电流，还可用于研究对线粒体功能至关重要的其他电导，例如钙离子或腺嘌呤核苷酸等代谢物的电导。

将安乐死的小鼠仰卧放置，喷洒酒精以清洁并浸湿毛发。随后，在胸部做一处两厘米的切口。用镊子夹住皮肤后，从小鼠胸腔中分离出心脏，并用含有5毫升冷分离液的10毫升烧杯冲洗心脏，以彻底去除血液。

待心脏中的血液残留清除干净后，将其转移至另一个含有5毫升冷分离缓冲液的10毫升烧杯中，并切成薄片。随后，将其转移至预冷的10毫升玻璃匀浆器中。使用机械搅拌器在冰上以每分钟275转的可控速度，对预切组织进行6次轻柔匀浆。

将匀浆转移至预冷的15毫升圆锥形离心管中，在4°C条件下以700 × g离心10分钟，使细胞核和未破碎的细胞沉淀。将上清液收集到新的15毫升离心管中，并置于冰上。在4°C条件下以8,500 × g离心上清液10分钟，获得含有线粒体的沉淀。

将线粒体沉淀重悬于 3.8 毫升预冷的高渗甘露醇缓冲液中，将线粒体悬液置于冰上孵育 10 至 15 分钟。将线粒体高渗甘露醇悬液注入预冷的法式高压破碎仪小型加压腔中。然后，将加压腔安装到法式高压破碎仪上。

然后，选择法式压滤器的低档模式，将悬液通过微型加压细胞进行压榨，棕色脂肪线粒体的调节刻度为110，心脏线粒体为140，确保悬液以每秒约一滴的速度从微型加压细胞中流出。将滴出的液体收集至预冷的15毫升冰上锥形管中。在4°C条件下，以10,500 ×g离心10分钟。

将线粒体外膜沉淀重悬于 0.5 至 2 毫升预冷的高渗氯化钾缓冲液中，并将悬液置于冰上保存。在记录当天，使用微量移液器拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃毛细管，设置拉制程序以确保移液器具有高度可重复性。将一根玻璃毛细管插入拉制仪中，拉制后可从一根硼硅酸盐毛细管获得几乎两根相同的膜片钳移液器。

当拉制仪的加热盒灯丝老化导致在拉制循环之间移液管性能不一致时，需调整程序。将移液管放入移液管抛光仪中，并在100倍放大倍数下将尖端置于灯丝附近进行火焰抛光。多次踩下脚踏板以加热灯丝，注意避免堵塞或损坏尖端弧度。

用基于TMA的移液管溶液填充后，将移液管打磨至电阻为25至35兆欧。将盖玻片预先用0.1%明胶孵育，以减少线粒体外膜-基质融合体（mitoplast）的黏附，并在接种mitoplast悬液前用氯化钾浴液冲洗盖玻片。通过将约35微升浓缩的mitoplast悬液与500微升氯化钾浴液混合，制备初步稀释液，并将其滴加到先前置于四孔板中某一孔内的盖玻片上。

将盖玻片置于冰上孵育15至20分钟，使线粒体外膜破裂后的线粒体（mitoplasts）沉降到盖玻片表面。用约50微升氯化钾浴液完全填充浴槽室，使用带弯曲尖端的细小解剖镊子将带有mitoplasts的盖玻片转移至室内。在不灌流的情况下将盖玻片安置于室底部，以保持mitoplasts在盖玻片上的稳定性。

在显微镜下使用60倍物镜扫描盖玻片，选择一个非粘附性的线粒体外膜破裂的线粒体（mitoplast）。用移液管溶液填充移液管，并将其放入移液管架中。使用显微操作器将移液管移入浴液，并将其移动至所选线粒体的正上方，以接近内膜（IMM）。

将膜电位钳制在0毫伏，使用放大器程序中的膜测试命令施加10毫伏的脉冲。施加轻微负压，以快速与线粒体内膜（IMM）形成吉欧封接（gigaseal）。将带有附着线粒体外膜破裂后形成的有膜片的移液管提起，使其远离盖玻片，以避免实验过程中因移液管漂移导致封接破裂。

在测试全线粒体膜片构型之前，使用放大器程序中的膜测试命令补偿杂散电容瞬变，以在线粒体膜片破裂后获得准确的线粒体膜电容测量值。通过放大器程序施加短时电压脉冲，使玻璃移液管下的膜片破裂，从而实现全线粒体膜片构型。膜片破裂后，使用放大器程序的膜测试功能拟合电容瞬变，以评估膜电容及其串联电阻。

破膜后立即通过灌流将氯化钾浴液更换为HEPES浴液。使用放大器程序施加一个850毫秒的斜坡电压方案。施加斜坡电压方案可诱导棕色脂肪线粒体内膜（IMM）产生大幅度的质子电流，而无需添加外源性脂肪酸（即UCPs所需的激活剂）。

使用 UCP1 抑制剂二磷酸鸟苷或 10 毫摩尔甲基-β-环糊精进行灌流以提取内源性膜脂肪酸后，通过残余电流来确定 UCP1 电流的幅度，该电流在 UCP1 缺陷小鼠的线粒体内膜（IMM）中完全消失。与棕色脂肪不同，骨骼肌和心脏等非脂肪组织的线粒体内膜在膜破裂后不会立即产生可测的质子电流。为了通过腺苷酸转运蛋白（AAC）诱导出可测的质子电流，必须使用含有 1 至 2 微摩尔外源性脂肪酸的 HEPES 浴液。

为了证实所测得的质子电流由AAC介导，必须使用特异性抑制剂——羧基苍术苷，该抑制剂几乎可完全抑制AAC1缺陷小鼠线粒体内膜中观察到的质子电流。只有当膜两侧均存在ADP以通过AAC介导活跃的核苷酸交换时，质子漏电流才会达到稳定但始终不完全的抑制状态。线粒体裸粒（mitoplast）制备的质量将影响获得完整线粒体裸粒膜片钳构型的成功率。

优化该方法至关重要。一旦通过膜片钳技术解析线粒体产热的分子机制，线粒体耗氧量的测定将揭示质子电流和产热在线粒体完整状态下的重要性。该技术为研究人员探索各类对线粒体功能至关重要的离子通道、离子和代谢物开辟了道路。