开发用于野外测量线粒体能量学的移动式线粒体生理学实验室

移动线粒体实验室的开发使生理学家能够将工作延伸到野外，从而可以评估动物表现出的各种有趣的能量挑战。对许多动物而言，圈养环境具有压力，因此通过移动实验室，我们现在可以将实验室带到动物所在之处，而无需将动物带回实验室。由于能够在野外分离并测量线粒体呼吸，原本主要用于生物医学的研究技术如今也可应用于生态学和进化生物学的研究背景中。

首先将移动实验室停放在平坦地面上，然后启动发电机并调平车辆。在安装设备之前，先展开滑动部分。接着按照制造商的说明，设置并校准线粒体呼吸室，使其达到实验所需的温度和当前大气压力。

使用剪切过的5毫升移液枪头将剪碎的组织转移至50毫升离心管中，并以50%功率用刀片匀浆5秒。为消化组织，按每克湿肌肉加入5毫克蛋白酶，作用7分钟，每隔30秒混匀一次溶液。通过加入含有牛血清白蛋白（BSA）的等体积分离缓冲液终止反应。

接下来，将匀浆在500 G条件下离心10分钟，然后使用剪去尖端的5毫升移液器吸头，将上清液穿过双层纱布转移至一个洁净的50毫升离心管中。随后将过滤后的上清液在3,500 G条件下离心10分钟，以沉淀出棕色的线粒体沉淀。弃去上清液后，向离心管中加入含有BSA的等体积分离缓冲液，用柔性刮勺轻轻刮下附着在离心管管壁上的线粒体沉淀并重悬，然后将离心管在3,500 G条件下再次离心10分钟。弃去上清液后，用不含BSA的分离缓冲液重悬沉淀，并重复上述离心步骤。

第二次离心后，使用洁净的柔性刮勺将线粒体沉淀重悬于重悬缓冲液中，并用剪去尖端的1毫升移液器吸头将重悬的线粒体转移至Dounce匀浆器中。用匀浆器轻轻匀浆线粒体悬液，进行四到五次吹打。使用新的剪去尖端的1毫升移液器吸头，将匀浆后的线粒体悬液转移至已标记的2毫升微量离心管中。

对于复合物I底物的线粒体呼吸测量，向线粒体呼吸室中加入945 µL呼吸缓冲液。当缓冲液温度维持在37°C时，确保搅拌器处于旋转状态。用顶盖密封呼吸室，然后开始记录数据采集。

待氧浓度稳定后，向检测室中加入20微升线粒体悬液，并盖上盖子。在软件中注明已将线粒体加入检测室。使用各自的注射器分别向检测室中加入10微升1摩尔的谷氨酸、200毫摩尔的苹果酸和200毫摩尔的丙酮酸，待信号稳定后，在软件中注明所添加的底物。

使用单独的注射器向反应室中加入五微升二磷酸腺苷（ADP）。在软件中注明所添加的ADP，并观察三态下快速的氧气消耗。当三态呼吸及线粒体耗氧减缓并持续四分钟，表明进入四态呼吸后，停止记录并保存数据文件。

对于复杂的双底物体系，通过向反应室中加入963微升呼吸缓冲液来重复上述步骤。加入20微升线粒体悬液后，使用不同的注射器依次向反应室中加入2微升浓度为4微克/微升的鱼藤酮和10微升500毫摩尔/升的琥珀酸。当信号稳定后，在软件中标记底物的添加。

加入5 µL ADP后，观察状态三的快速耗氧，并在软件中标注ADP的添加。当状态三呼吸及线粒体耗氧减缓并持续四分钟，表明进入状态四呼吸后，停止记录并保存数据文件。代表性结果展示了线粒体呼吸的原始数据。

复合物一底物的第三步陡峭斜率代表了较高的最大呼吸速率。通过四态下出现明显的拐点及新斜率的稳定，可观察到从后肢骨骼肌中成功分离出线粒体。对于由复合物二驱动的线粒体呼吸，也可观察到类似的模式。

线粒体功能不良导致线粒体复合物一驱动的呼吸作用发生偶联。然而，另一种典型的线粒体功能不良表现为复合物二线粒体呼吸的解偶联，在加入ADP后出现平直曲线，且无法进入状态四的测定。复合物一和复合物二的状态三、状态四以及呼吸控制比（RCR）的数值均从呼吸测量数据中确定。在样品采集过程中，可将额外的组织迅速冷冻，以备将来用于测定线粒体密度或氧化损伤。

此外，实验后还可将分离的线粒体冷冻，用于测定电子传递链复合物的活性。在野外分离并测定线粒体呼吸能力的技术将有助于加深我们对线粒体在复杂生命进化过程中所起作用的理解。