使用胶带法和手持式微阵列仪手动构建组织微阵列

组织微阵列（TMA）是一种重要的研究工具，它将来自福尔马林固定石蜡包埋组织块（称为供体块）的小型代表性组织样本（称为组织芯）整合到一个单一的石蜡块中。膜辅助法是一种完全手动的构建方法，通过在直立的组织芯周围浇铸石蜡来逆转构建过程，因此适用于非理想的供体块，并可使用价格低廉、广泛可得的一次性手持式组织微阵列仪。该过程的多步骤工作流程将由Mr. Lee Wisner和Dr. Brandon Larsen进行演示。

构建组织芯片（TMA）切片时需要牢记的最重要概念之一是：福尔马林固定石蜡包埋的组织切片中的组织实际上是三维结构。我们制作了以下动画以帮助解释这一概念。此处展示的动画呈现了一个福尔马林固定石蜡包埋的组织切片，显示了其中组织的三维特性。

可以看到组织位于包埋块的顶部，且该区域相当大。如果我们能够拥有透视能力，透过包埋块进行观察，可能会发现组织在包埋块内部深处的实际形状并非均匀一致，就像海洋中的冰山一样，表面所见未必能真实反映其下方的结构。在此组织包埋块内部，可能还存在其他在表面不可见的组织碎片。

在该组织深部的中心区域可能存在坏死或组织死亡的区域。病理学家应实际查看该组织块顶部的二维切片，并对切片进行标注，以标示出包含目标组织的区域，同时排除坏死或其他非目标类型的组织。为了便于对组织进行准确的芯样取样，病理学家应完成以下三项工作。

首先，病理学家将使用切片标记笔在切片上标记出感兴趣的组织区域，以避免取样其他无关组织。其次，如果在该感兴趣区域内存在需要避开的区域，病理学家可使用同一支标记笔将这些不应取样的区域涂黑。最后，最好使用另一种颜色的笔，由病理学家在感兴趣区域内标出最适合进行组织芯取样及构建组织芯片（TMA）的理想区域。

需要注意的是，当该过程完成时，组织构成可能会随着取样深度的增加而发生变化，这一点在接下来的动画中将有所展示：核心样本的位置决定了该样本的组成成分，而该成分会因组织的深度以及组织块中相应位置所含物质的不同而有所差异。例如，此处我们所展示的第一个核心样本仅获取了组织上半部分的一段，但在组织块更深层的位置，该取样区域已不再含有任何组织，因此仅采集到了石蜡。而我们在此处展示的第二个核心样本，则在其整个长度范围内均获取到了组织，因为在该位置，组织在整个组织块的深度范围内均存在。

第三个核心取样点捕获了一部分组织，随后在其无组织存在的中心区域捕获了一部分石蜡，最后在其底部区域又捕获了少量组织，该区域在组织块的底部存在组织。病理学评估完成后，汇总用于构建组织芯片（TMA）的供体组织块的最终列表，然后创建TMA图谱。TMA图谱是一种示意图，用于标明在完成的TMA中各核心的位置，以及从该TMA切下的载玻片组织切片中各核心的分布位置。

为便于定位，应确保组织芯片（TMA）图谱避免将组织芯置于均匀的矩阵中（例如 3×3 或 4×4 矩阵），并至少包含一个方向标记。由于胶带法通过将熔融石蜡浇注在倒置的组织芯周围来反转构建过程，因此需要创建第二张图谱，称为构建图谱，其为 TMA 图谱的镜像。构建图谱显示了在构建过程中每个组织芯应放置的位置，以确保其在最终完成的 TMA 中位于正确的位置。

地图创建完成后，准备金属TMA基底模具。使用一次性纸质方格网格来指导打孔位置。将纸质方格网格裁剪至合适尺寸，并在网格背面贴上一片双面胶带。

将网格和胶带放入金属托盘中，并在网格上方再添加一片双面胶带。覆盖经病理学复查的H&E 在待打孔的FFPE组织块上放置载玻片，利用病理医生的标记确定打孔位置。使用手持式手动打孔器（一次性或可重复使用），在FFPE供体组织块的适当区域进行打孔。

若使用可重复使用的打孔器，请确保在每次打孔前后均对其进行清洁。将组织芯从打孔器中推出，并使用针状镊子将推出的组织芯放置在覆盖双面胶带的网格十字线上。

确保将组织芯以倒置且直立的方式放置，使组织芯的组织端接触胶带，并位于构建图所示的正确位置。重复此步骤，直至所有供体组织块均完成取芯并将组织芯置于相应位置。待所有组织芯就位后，标记一个塑料包埋盒，并将其放置在含有组织芯的金属底座上方。

核心的高度不得超过金属托盘的深度，否则在将盒体放入时，过高的核心会发生倾斜或倾倒。将熔化的石蜡通过盒体缓慢倒入核心托盘中。让熔融石蜡自然溢出，以确保组织芯片（TMA）内部无气泡残留。

确保石蜡完全填充至包埋盒顶部，使包埋盒在石蜡凝固后能够完全包埋并牢固地固定于石蜡块中。将石蜡块在室温下静置冷却30分钟，此期间不得移动石蜡块。随后将石蜡块置于4°C冰箱中再冷却30分钟，以确保其完全凝固。

完全凝固后，轻轻分离金属底座模具，并从石蜡块上去除双面胶带。组织芯片（TMA）构建完成后，使用切片机对新的TMA进行切片。当蜡块切至适当表面后，收集完整的全层面组织切片。

将切片转移至预热的水浴中，展平后贴附于载玻片上。待切片干燥后，送代表性切片进行苏木精-伊红（H&E）染色，以及任何其他可能需要的免疫组织化学染色。将染色后的组织芯片（TMA）切片送病理科进行病理学评估。

对于组织微阵列（TMA）的验证，病理学家应复查来自TMA包埋块的H&E切片，并在显微镜下逐一检查每个圆形组织点，以确认目标组织是否存在。构建过程中的一个关键步骤是识别特定供体包埋块中需要取材的感兴趣组织区域，以获取TMA组织芯。本图第一列展示了病理学家标记后的典型供体H&E切片示例。

第二列显示了H&E染色组织的打孔区域。第三列显示了从供体蜡块中获取的组织微阵列（TMA）核心的H&E染色组织，这些区域如第一列和第二列所示。病理学家可同时查看配对的供体蜡块和TMA核心的H&E染色切片，以确认目标区域已被成功采集，并且组织成分保持一致。

通过胶带法成功完成组织芯片（TMA）有两个主要评价指标。第一个指标是组织芯点出现在预期位置且彼此间距正确，可通过肉眼观察进行评估。图A和图B显示了两个成功制备的胶带法TMA及其相应的H&E染色切片。

对这些TMA切块进行肉眼观察显示，每个TMA及其相应切片中的组织芯均存在且排列规则。在胶带法构建过程中可能出现的一些主要问题包括：在石蜡完全凝固前过早移除金属底座，导致组织块与包埋盒分离，如图C所示；在倒入熔融石蜡时若操作过于剧烈，可能导致已包埋的组织芯倾倒和/或位置偏移，如图D所示，此问题可能因双面胶带粘附性差而加剧。本图展示了每个组织芯的H&E染色结果，为一个典型的TMA示例。

除一个核心点外，其余所有核心点均在H&E染色中可见。该图还显示，部分核心以完整的圆形组织点形式存在，而另一些则未完全保留。此类组织丢失并不罕见，可能是由于包埋块修切不足，未能充分暴露所有核心所致。

或者，组织缺失或完全缺损可能是由于该组织芯的组织质量较差，导致在染色过程中发生组织丢失。在下图中，对组织芯片（TMA）切片进行了免疫组织化学和RNA原位杂交染色，以进一步验证TMA的质量。如图所示，可根据构建TMA所用的组织类型选择多种不同的染色方法。

波形蛋白（vimentin）用作质控指标。U6 用于评估 RNA 质量。EBER 用于确定 EB 病毒（EBV）状态。

CD20 是一种B细胞标志物，用于指示B细胞的存在。这些是可用于帮助验证组织芯片的一些染色方法。观看本视频后，您应了解如何使用胶带法制作组织芯片，以及组织芯片为何是重要的节省时间和资源的研究工具。

还应认识到，组织微阵列（TMA）构建并非一个理想化的过程，持续的病理学指导和审查不仅是构建过程中的关键环节，对于在TMA切片上进行的免疫组织化学研究同样至关重要，以确保目标组织确实存在于TMA切片中。