使用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能与活性

该方案可通过直接评估KCC2的激酶分子大小磷酸化，帮助理解KCC2调控所涉及的机制，从而揭示其生理功能与活性。即使目标蛋白表达量极低，该技术也可用于从复杂的相关分子混合物中鉴定和表征目标分子（如蛋白质）。该技术是复杂系统蛋白质分析以及识别组织功能异常或疾病潜在机制的重要工具。

演示实验操作的是我实验室的博士生Sunday Solomon Josiah。首先，将所有试剂预先置于37摄氏度的珠浴中，并在珠浴中将稳定转染的大鼠KCC2b人胚胎肾293细胞完全解冻。随后，将细胞从冻存管转移至含有5 mL新鲜培养基的离心管中，并在1,200 ×g条件下离心3至5分钟。

使用连接真空泵的吸液管吸去上清液后，将细胞重悬于10毫升新鲜培养基中。将细胞悬液转移至10厘米培养皿，在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养48小时。待细胞达到90%融合度时，吸去旧培养基，用2毫升PBS洗涤细胞，进行传代。

加入两毫升胰蛋白酶，在室温下孵育约一到两分钟。用两毫升完全培养基洗涤经胰蛋白酶处理的细胞。向新培养皿中加入九毫升新鲜培养基。

然后将1毫升旧培养皿中的溶液加入新培养皿中。将分装后的细胞培养皿放入培养箱中培养48小时，使其融合度达到90%以上。在裂解缓冲液收获细胞前，用二甲基亚砜、8微摩尔星形孢素或0.5毫摩尔N-乙基马来酰亚胺处理细胞15分钟。

吸弃横切培养皿中的培养基，将培养皿置于冰上，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸弃 PBS，向培养皿中加入 1.0 毫升预冷的裂解缓冲液。用预冷的塑料细胞刮棒将细胞从培养皿底部刮下后，将细胞悬液转移至置于冰上的微量离心管中，并在 4°C 下持续振荡 30 分钟。

在低温离心机中离心细胞裂解液后，立即将其置于冰上。将上清液收集至预冷的干净离心管中，并弃去沉淀物。用移液器吸取 300 微升 Protein G Sepharose 加入微量离心管中。

然后以500 G离心溶液2分钟。弃去上清液后，加入500微升PBS，充分涡旋混匀。离心后再次弃去上清液，并重复该步骤。

接下来，将一毫克抗KCC2苏氨酸906和抗KCC2苏氨酸1007抗体与200微升Protein G Sepharose珠混合，再用PBS定容至500微升。在4摄氏度下于振荡平台或旋转轮上摇动两小时后，用PBS重复洗涤两次。对细胞裂解液进行蛋白质定量，然后将一毫克细胞裂解液加入洗涤后的珠中，在末端对末端旋转仪中孵育，随后离心沉淀。

用含有150毫摩尔氯化钠的PBS洗涤三次，随后用200微升PBS洗涤三次，然后将最终沉淀重悬于100微升LDS样品缓冲液中。在室温下将试管置于旋转摇床中振荡5分钟。将试管在加热块中孵育后离心，取上清液用于上样凝胶。

组装 Western Blot 制胶装置，并倒入新配制的 8% 分离胶以制备凝胶，灌胶至距离玻璃板顶部约两厘米处。向装置中加入 200 微升无水异丙醇，室温静置 60 分钟。用移液器吸除异丙醇，并用约 200 微升蒸馏水小心冲洗凝胶表面。

加入新配制的6%浓缩胶至制胶装置后，轻轻插入样品梳，室温静置30分钟。随后将凝固好的凝胶固定于电泳槽中。向电泳槽中加入电泳缓冲液后，在第一孔中加入5 µL分子量标准品，其余各孔每孔加入等量的蛋白质样品。

用 LDS 填充空孔，在 120 伏电压下电泳约 90 至 120 分钟。用含有 20% 甲醇的转移缓冲液重新水化硝酸纤维素膜。用转移缓冲液冲洗凝胶和膜，并将其轻轻铺展在制备好的转膜夹心中。

按以下顺序组装待转移的“三明治”结构：负极、三明治泡沫垫、经漂洗的SDS-PAGE凝胶滤纸、经漂洗的硝酸纤维素膜、滤纸、三明治泡沫垫、正极。组装完成后，将该结构放入转移槽中，以90伏电压运行90分钟，或以30伏电压运行360分钟。随后，使用封闭缓冲液在室温下封闭干燥的膜1小时。

将膜在封闭缓冲液中加入适当稀释的一抗和 beta-actin，室温孵育一小时，或 4°C 过夜。随后用 TBST 洗涤三次，每次五分钟。将洗涤后的膜加入用封闭缓冲液稀释的二抗中，孵育 60 分钟，再重复进行三次 TBST 洗涤。

完成后，将洗涤后的膜置于成像板上。为显影信号，在将成像板转移至成像系统前，将等体积混合的两种增强型化学发光试剂配制的溶液均匀覆盖于膜上。用星形孢菌素和N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理HEK293细胞后，内源性表达的SPAK蛋白在其靶位点的磷酸化水平降低，这些靶位点包括位于T环激酶结构域内的苏氨酸233位点以及S环磷酸化位点丝氨酸373。

星形孢菌素降低了稳定表达KCC2b的HEK294细胞中丝氨酸940位点的磷酸化水平，而NEM则显著增加了该位点的磷酸化。此外，星形孢菌素降低了苏氨酸505位点的磷酸化水平，而NEM在相同位点仅引起轻微但无统计学意义的磷酸化增加。这两种化合物对蛋白激酶C在苏氨酸505位点以及KCC2b在丝氨酸940位点的磷酸化所产生差异性效应具有良好的相关性。

代表性结果还显示，NEM 导致总 KCC2 表达量显著增加，而总 NKCC1 和 SPAK 的表达量在两种化合物处理后均无显著变化。此外，这两种化合物均导致 SPAK 在苏氨酸 233 位点和丝氨酸 373 位点的磷酸化水平降低，这分别与 NKCC1 内源性表达时苏氨酸 906/1007 位点以及苏氨酸 203/207/212 位点的磷酸化减少相关。另外，星形孢菌素和 NEM 分别降低了蛋白激酶 C 在丝氨酸 940 位点的磷酸化水平，同时增加了稳定表达的 KCC2b 的磷酸化水平，这分别与星形孢菌素和 NEM 处理后蛋白激酶 C delta 在苏氨酸 505 位点的磷酸化水平降低和升高相关。

如果使用了不合适的初级或次级抗体，则在成像过程中将无法观察到条带。此外，若抗体浓度过低，信号也可能不可见。该技术是蛋白质定量分析中的重要工具，已使其被广泛应用于多种科研和资源利用领域，包括作为有效的早期诊断工具。