从P3HR1细胞系中分离与定量EB病毒

该方法可使我们从P3HR1细胞系中分离出EB病毒颗粒，并对病毒原液进行定量，以便用于各种研究目的。该技术的主要优势在于，它提供了一种相对简便、经济、快速且可靠的EB病毒原液制备方法。通过该技术产生的具有活性的病毒颗粒，可用于多种体外或体内实验模型，以进行EB病毒的相关诊断。首先，在一个15毫升的锥形管中制备一定体积的细胞悬液A，调整体积，使细胞数量约为每100毫米培养皿220万个细胞。

向试管中加入5毫升完全培养基。向试管中加入80微升二甲基亚砜。然后向试管中加入350微升浓度为1毫克/毫升的PMA。

PMA 的终浓度应为 35 纳克/毫升，DMSO 的终浓度应为 0.08%。加入 4.27 毫升培养基，使总体积达到 10 毫升。通过倾斜混匀管内溶液，然后将内容物转移至 100 毫米的培养皿中。将培养皿置于细胞培养箱中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育五天。

将培养板中的内容物在孵育箱中孵育五天后，于120 ×g离心八分钟，使细胞沉淀。收集含病毒的上清液，并弃去细胞沉淀。再次于4 °C、16,000 ×g离心90分钟，使病毒颗粒沉淀。弃去上清液，将病毒沉淀重悬于5 mL培养基中。将病毒悬液分装至20管，每管含250 µL病毒悬液，并于-80 °C保存。

为了将蛋白质与DNA分离，向含有病毒制备物的离心管中加入500微升Tris饱和酚。加入100微升水，充分涡旋振荡以形成粉红色乳状液。在9,650 ×g条件下离心15分钟，收集上清液并转移至新的1.5毫升微量离心管中。

加入相当于上清液体积十分之一的冰冷乙酸钠，用移液器吹打混匀。然后加入1微升浓度为20毫克/毫升的糖原溶液，再次通过移液混匀。加入上清液体积三倍的冰冷100%乙醇，于-80摄氏度保存过夜。

为了分离病毒DNA，在4°C条件下以9,650 G离心15分钟。弃去上清液以获得DNA沉淀，并用1毫升冰冷的70%乙醇洗涤沉淀三次。再次以9,650 G离心15分钟，弃去上清液。

将沉淀物在空气中干燥约10分钟后，用10至50微升无核酸酶的蒸馏水重悬沉淀。将样品在-20摄氏度保存以备后续处理，或在4摄氏度下过夜以确保DNA充分溶解，随后转移至-20摄氏度保存。用精细擦拭纸清洁微量分光光度计的测量台后，加载1微升制备好的DNA样品，并记录样品中DNA的浓度。

检测 260 与 280 纳米以及 260 与 230 纳米处的吸光度比值。DNA 在 260 纳米处有吸收峰，蛋白质在 280 纳米处有吸收峰，而苯酚等有机物质在 230 纳米处有吸收峰。比值在 1.8 至 2.0 之间被认为适用于实时 PCR。

配制PCR反应体系时，将5微升Cyber Green实时PCR预混液加入0.2毫升PCR管中。向每根PCR管中加入1微升浓度为7.5皮摩尔/微升的正向引物和1微升浓度为7.5皮摩尔/微升的反向引物。此处扩增的是EBV小RNA 2基因。

为了确定EBV基因组拷贝数，向其中一个试管中加入2 µL无核酸酶水和1 µL病毒DNA。反应体系总体积为10 µL。

准备其他将用作标准品的试管，其中含有已知的EBV基因组拷贝数。首先在95摄氏度下激活5分钟，随后进行PCR扩增反应。然后进行40个循环：95摄氏度下15秒，58摄氏度下30秒。

将所有数据表导出为 CSV 文件，并计算每根标准管中 EBV 基因组拷贝数的对数值以及平均 CQ 值。通过将标准品的 CT 值对其基因组拷贝数的对数值作图，生成 qPCR 标准曲线。利用标准曲线图的拟合方程，推算出含有诱导病毒 DNA 的 PCR 管中 EBV 基因组的拷贝数。

最后，使用屏幕上显示的公式计算诱导病毒制剂的浓度。其中，X 是根据标准曲线得出的 EBV 基因组拷贝数，F 是用于建立 PCR 反应中 DNA 的稀释倍数。此处展示了使用血细胞计数板进行细胞计数的方法。

使用光学显微镜计数四个象限。此处应计数标为蓝色的细胞，而标为红色的细胞不应计数，因为它们接触了象限的上、右、下或左边界。已开展优化实验，以确定可产生最多EBV颗粒的PMA和二甲基亚砜浓度。

DMSO 浓度为 0.8% 且 PMA 浓度为每微升 35 纳克时效果最佳，可获得较高的 EBV 浓度。本实验室利用该技术产生的活病毒颗粒来研究针对此病毒的促自身免疫或炎症反应，并用于开发新型抗 EBV 药物。