设计生物反应器以提高工程化心肌组织的数据采集效率与模型通量

我们开发的三维干细胞来源人源心肌的体外模型，相较于传统二维细胞培养，显著提升了生物学保真度，同时避免了实验室动物实验中存在的种间差异。本研究采用的多组织生物反应器设计结合稳定的收缩后追踪系统，可最大化组织培养成功率，并提高对工程化心肌组织功能进行深入表征的准确性。鉴于心力衰竭仍是全球首要致死原因，我们构建的工程化心肌组织为研究人员提供了模拟人类心脏疾病以及筛选潜在治疗方法的有效平台。

首先，将四个铝制阴性母模放置在模具架中，使柱孔与三角形搁板相对一侧的空隙对齐。将装置置于两个平行支架之间，并使用一块厚度为0.5毫米的矩形硅胶片作为垫圈夹紧两侧，以防止液态PDMS泄漏。在浅容器中，按1比10的比例混合0.5毫升PDMS固化剂与5毫升PDMS弹性体基质，充分搅拌五分钟。

将PDMS混合物置于真空腔内，在强真空条件下脱气，直至气泡完全消失。接着，将PDMS混合物倒入浇铸装置中，过量填充以确保每个槽位均被完全覆盖。在PDMS支架主体上、与带柱一侧相对的位置加入少量彩色玻璃珠，用于每个支架的唯一标识。

将浇铸装置水平放置于真空腔内，确保其处于水平状态，在强真空条件下至少放置12小时。将PDMS在无尘环境中于室温下静置固化48小时，以确保完全固化并达到微柱结构的最大强度。从浇铸装置上拆除夹具、支架和硅胶片。

使用不锈钢剃须刀片，切除浇铸装置顶部及框架支撑上的PDMS薄膜。用手指将PDMS支架从模具支架的侧边分离。将钝化的不锈钢剃须刀片插入模具与模具支架之间的空隙中，撬开两者，确保填充在空隙中的PDMS保留在模具支架上。

然后，使用锋利的不锈钢刀片，从柱体尖端切除剩余的 PDMS 薄膜以及无用区域的 PDMS。用手指缓慢地从柱体对侧将 PDMS 支架与模具分离。持续交替两侧进行分离，直至柱体完全脱离主模具。

按照之前演示的方法，释放所有PDMS支架和柱体，并使用锋利的剃刀刀片修剪掉支架上残留的多余PDMS。使用热塑性熔融沉积成型3D打印机打印稳定柱体追踪器（SPoT）铸模装置的各个部件。确保3D打印部件之间，以及PDMS支架与三叉夹具之间具有牢固的压合配合。

同时确认PDMS支架与柱体紧密贴合，柱体恰好到达孔底且未发生弯曲。取0.5毫升黑色PDMS组分A与0.5毫升组分B置于小型称量皿或浅容器中，混合至溶液颜色均匀。将混合后的黑色PDMS置于真空腔内，在强真空条件下脱气20分钟。

将脱气后的黑色PDMS倒入3D打印的基座中，填满孔洞，并轻敲以确保无气泡残留。尽可能刮去基座上多余的PDMS。将三叉部件卡接到基座上，然后将PDMS支架放入三叉夹具的凹槽中，确保支柱的末端浸入圆形孔穴中的黑色PDMS内。

将黑色PDMS在无尘环境中室温固化48小时。轻轻滑出三叉形部件，尽量减少对支柱的张力。使用小型镊子，刮去每个SPoT周围的一层薄黑色PDMS膜，然后将细尖弯曲镊子插入SPoT孔中，使其从3D打印基座上分离。

使用精细的万能剪刀检查SPoTs并修剪掉铸造过程中残留的黑色PDMS薄膜。通过将PDMS支架安装到polys手机框架上，然后将其滑入黑色底板，确保成品支柱长度正确。在对生物反应器进行高压灭菌并准备好细胞混合物后，开始制备hECTs。

佩戴无菌手套，从装有生物反应器部件的已灭菌袋中取出黑色底板，放入60毫升培养皿中，确保孔朝上。用移液器缓慢向每个孔中加入44 µL细胞混合液，避免产生气泡。更换一副新的无菌手套，从灭菌袋中取出带有PDMS支架的聚砜框架。

将框架放置在底板上，使框架的两端嵌入底板末端的凹槽中。确保支柱均保持垂直且框架无倾斜，将生物反应器放入60毫米培养皿中。在hECTs固化过程中，向60毫米培养皿中加入1毫升含10%FBS的心肌细胞维持培养基，以提高湿度。

将无盖的培养皿放入一个高型100毫米培养皿中，并用100毫米培养皿盖覆盖，然后将生物反应器放回37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，使胶原蛋白与悬浮细胞形成凝胶。两小时后，从培养箱中取出培养皿。加入13毫升含10%胎牛血清的心肌细胞维持培养基，倾斜培养皿，使培养基在聚四氟乙烯（PTFE）底板与聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架之间流动。

从侧面检查生物反应器，确保无气泡，然后将培养皿放回培养箱。若存在困住的空气，可将生物反应器从培养基中倾斜抬起，使气泡破裂，再缓慢将其重新浸入；或使用带有加样枪头的微量移液器虹吸去除空气，同时避免扰动支柱。通过支架上的观察窗检查心肌组织工程心脏组织（hECT）的收缩情况。

在24至96小时内，人工程化心脏组织（hECTs）会逐渐收缩并变得不透明。当hECTs的直径较原始直径收缩至少30%时，移除基板。用心肌细胞维持培养基填充含有生物反应器的60毫米培养皿，直至液体与培养皿边缘齐平，并向一个新的60毫米培养皿中加入14毫升培养基。

佩戴无菌手套，将生物反应器在其培养皿中翻转，使底板朝上。检查是否有滞留的气泡后，缓慢抬起底板，保持其水平。确保柱尖处于焦点位置。

打开阈值开关，并调节滑块，直至SPoTs清晰分界，且在hECT收缩过程中形状保持稳定。使用矩形工具在其中一个SPoTs周围绘制矩形，然后点击“post boundaries”框内的“set one”按钮，以确定矩形相对于该SPoT的位置，确保SPoT始终位于矩形边界内。对另一个支柱重复此操作，并在“set two”下进行记录。

调整物体大小设置，以防止程序追踪较小的物体，并确保每个矩形内追踪的物体数量保持恒定。界面会实时显示被追踪物体之间的测量距离。利用该图表监控噪声。

在“起搏频率赫兹”标题下，设置所需的频率范围以及从最小值到最大值的步进间隔。在右侧的输入框中，选择适当的设定时间，以允许人诱导性心外膜组织（hECT）适应新的起搏频率，然后指定记录时间及起搏电压。点击“开始程序”按钮以启动程序。

在记录完一个频率的数据后，将刺激器频率按所需间隔递增，进行下一次记录，直至达到最大频率。以下是从底部观察到的人工工程化心肌组织（hECTs）的代表性图像，分别显示了未使用SPoTs和使用SPoTs时的情况。SPoTs在数据采集过程中提供了一个单一且明确的形状，便于追踪。

在某些极端情况下，追踪目标甚至被部分遮挡。一种更可靠的形状设计实现了更稳定的光学追踪并降低了噪声，从而能够测量产生低至一微牛顿（1 µN）牵引力的微弱组织。SPoTs 提供的帽状几何结构可防止 hECT 脱落。

在当前带有加热载物台的起搏设置下，测得的人工工程化心肌组织（hECT）功能在长期培养过程中保持稳定。与生理温度下的测量结果相比，室温下hECT表现出不同的收缩动力学特征，收缩和舒张速率均较慢。在较高频率刺激下，室温中的hECT收缩力趋于减弱。

在较低频率下，室温时hECTs的收缩力往往更强。当在36摄氏度下进行起搏时，hECTs具有更高的自发搏动频率以及更宽的起搏频率捕获范围。温度可控的环境可确保所测得的hECTs功能具有生理相关性。

此外，多组织生物反应器共用的培养基环境有助于研究不同细胞组成的hECTs之间的旁分泌信号传导。在多组织生物反应器中加入SPoTs，可使研究人员高效研究张力异常升高或降低的病变心肌组织，而此类组织在未加帽的支柱末端容易滑脱。