基于质谱靶向蛋白质分析中低丰度蛋白质的微采样技术

本方案逐步介绍了如何制备用于亲和纯化和蛋白质蛋白水解的磁珠，以及如何利用这些磁珠从干燥的微量样本中检测低丰度蛋白质。其主要优势在于为您提供了一套工具，可从小体积样本中高效地制备并采集复杂的样品。只要您拥有能够有效捕获目标蛋白质或其特征性肽段的高效抗体，该方法即可适用于其他蛋白质生物标志物。

在对抗体进行酸处理调节pH值时需格外小心，尤其是当制备的微珠体积较小时。首先，将所需体积的抗体溶液转移至一个5毫升低蛋白结合的微量离心管中，并向抗体溶液中加入一个小的磁力搅拌子。使用带有微电极的pH计测量pH值，先加入10 µL 1 M盐酸调节pH，随后当pH接近2.5时逐步减少盐酸加入量。

记录将 pH 值调节至 2.5 所需的 1 摩尔盐酸的总体积。取出微电极，将酸化后的抗体置于冰上，在磁力搅拌器上孵育 1 小时。为中和抗体溶液，测量其 pH 值，并先加入 10 µL 1 摩尔氢氧化钠将其 pH 值调至 7；随着 pH 值接近 7，逐步减少氢氧化钠的用量。

记录所加入的一摩尔氢氧化钠的总体积。在涡旋混合器上充分混匀磁珠悬浮液，并取出含有所需量磁珠悬浮液的体积。例如，若要制备一毫升磁珠悬浮液，应取出含有20毫克磁珠的体积。

将磁珠悬液置于磁力架上静置1分钟，移除上清液。用与悬液体积相等的I型水洗涤磁珠两次，每次加入洗液后使用涡旋混合器混匀。然后再次将溶液置于磁力架上静置1分钟，按前述方法移除上清液。

加入经酸处理的抗体、0.5摩尔的硼酸盐缓冲液以及用于抗体偶联的偶联缓冲液至磁珠中。使用涡旋振荡器混匀，然后在室温下使用翻转式样品混合器（建议采用往复旋转和振动模式）旋转孵育过夜。随后，在239 g离心力下离心10分钟。

将试管置于磁力架上两分钟，移除上清液。洗涤磁珠后，再次将试管置于磁力架上一分钟，按相同步骤移除上清液。将磁珠重悬于所需缓冲液中，按所需的储存浓度保存于冰箱中。

按照制造商的说明，使用10微升定量吸收微采样（VAMS）吸头收集10微升血清，并在室温下晾干至少两小时。将VAMS从支架中取出，放入一个2毫升低蛋白结合微离心管中。加入1,000微升100毫摩尔/升的碳酸氢铵溶液，在22摄氏度下以每分钟1,000转的速度使用温控混匀仪提取一小时。

将提取物转移至新的1.5毫升低蛋白结合微离心管中，用于胰蛋白酶消化。向每份VAMS提取物中加入30微升洗涤后的胰蛋白酶磁珠以启动消化反应，在37摄氏度、1,000 rpm条件下使用温控混匀仪或类似设备孵育2小时。在2,655 g条件下离心5分钟，将上清液转移至新的2毫升低蛋白结合微离心管中。

向每支含有消化后VAMS提取物和内标（IS）的低蛋白结合微离心管中加入25微升含稳定同位素标记肽段的内标（IS）溶液（14纳克/毫升，溶于100毫摩尔/升碳酸氢铵溶液中）。向每支管中加入两份20微升洗涤后的磁珠悬浮液。在室温下使用翻转混样仪进行1小时的免疫萃取。用500微升含0.05%聚山梨酯20的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤磁珠。

从磁力架上取下含有磁珠和洗涤液的低蛋白结合微离心管，小心倒置直至溶液均匀。然后将低蛋白结合微离心管放回磁力架上静置30秒，再倒置30秒，再次放回磁力架上静置1分钟。吸除洗涤液，并用PBS、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）和碳酸氢铵对磁珠重新洗涤。

向每个样品中加入15微升含2%甲酸的I型水，然后在22摄氏度、1,000 rpm条件下使用温控混匀仪或类似设备孵育5分钟，以洗脱捕获的肽段。将洗脱液置于磁铁上1分钟后，转移至新的1.5毫升低蛋白结合微离心管中。重复一次上述步骤，并将第二次洗脱液与第一次洗脱液合并至同一支低蛋白结合微离心管中。

向每份洗脱液中加入 20 微升 100 毫摩尔的碳酸氢铵。离心后，将 40 微升洗脱液转移至 HPLC 小瓶的微插件中。在仪器软件中，将色谱柱温箱温度设置为 25 摄氏度，流速设置为 50 微升每分钟。

然后将样品放入自动进样器中。使用LC-MS/MS系统配套的软件，设置待测样品的运行序列，并将进样体积设为10微升。在仪器软件中点击“运行序列”以启动分析，记录亲和捕获的ProGRP特异性胰蛋白酶肽及其内标（IS）的峰面积。此处展示了通过VAMS和干血清斑点（DSS）采样后，以及将血清样本直接添加至提取液中的加标样本所获得的特征肽段和内标的质谱（MS）色谱图。

本图展示了将含有 ProGRP 的血清样本添加至 VAMS、DSS 或直接加入提取液后，特征性 ProGRP 肽段与内标（IS）的峰面积比值的代表性结果。从结果可以看出，VAMS 获得的面积比值与对照样本相似，表明采样材料无损失；而 DSS 的面积比值显著降低，表明采样材料存在损失。本图还展示了完整蛋白质提取与特征性表位肽段提取后基峰色谱图的比较。

当您自行制备抗体或酶包被的微珠时，可以根据特定需求定制微珠，适用于靶向蛋白质检测和全局蛋白质组学分析。采用VAMS和干血斑样本进行蛋白质检测的高灵敏度方法，使得在更广泛疾病的随访中，能够实现以患者为中心的院外检测等个体化诊疗方案。