基于DNA条形码的多重免疫荧光成像分析基因重编程小鼠黑色素瘤的福尔马林固定石蜡包埋样本

我们提出了一种开发和验证多重免疫荧光组合的方案，以研究小鼠FFPE组织，并通过研究用递送血浆DNA的纳米颗粒处理的黑色素瘤模型的样本来证明其实用性，编码用于重新编程肿瘤微环境的免疫信号。该领域缺少与小鼠福尔马林固定石蜡包埋FFPE组织兼容的严格开发和验证的多重免疫荧光方案。

福尔马林固定石蜡包埋可长期保留组织形态，易于处理和储存，并能够创建组织微阵列，以便在一张载玻片上查看多个标本。

空间蛋白质组学成像将增强复杂肿瘤微环境的可视化和分析，最终有助于预测免疫反应，从而有助于开发更好的治疗方法。

我们将使用该协议来改进跨更多肿瘤类型和不同免疫器官的小鼠肿瘤模型的空间分析。

[旁白]首先，将FFPE组织载玻片在60摄氏度下烘烤过夜。第二天，在室温下冷却载玻片10分钟，然后开始脱蜡和再水化。接下来，将载玻片在二甲苯溶液中孵育两次，每次五分钟以除去石蜡，然后通过将载玻片通过 100% 乙醇移动两次，每次五分钟来使组织再水化。将载玻片依次放入 90%、70%、50% 和 30% 乙醇溶液中，各 5 分钟。用蒸馏水清洗载玻片两次，每次五分钟。进行抗原修复，然后使用新鲜的漂白溶液漂白组织两次，间隔 45 分钟，然后进行抗体染色。接下来，使用塑料室在 4 摄氏度下进行抗体染色过夜。染色后，取出塑料室并收集先前应用的抗体混合物。在染色缓冲液中洗涤载玻片两次，每次两分钟。将载玻片在装有 40 毫升染色后固定溶液的染色罐中孵育 10 分钟，然后用 PBS 冲洗 3 次，每次 2 分钟。现在将载玻片转移到冰冷的甲醇中五分钟，然后用PBS冲洗。在湿度室下将 200 微升最终固定溶液涂抹在每张载玻片上。在室温下孵育20分钟后，再次在PBS中洗涤载玻片三个循环，每个循环2分钟。如果立即成像，请使用无绒纸巾擦拭组织周围的载玻片。使用流通池组装设备按压流通池 30 秒。如果稍后成像，请将载玻片储存在不将流通池应用到4摄氏度的储存缓冲液中。准备好成像时，将载玻片从储存缓冲液转移到 PBS 中 10 分钟，然后再应用流通池。接下来，根据所需的成像周期制备磨合 DMSO 缓冲液。制备成像循环总数所需的报告储备溶液。将 250 微升报告储备液和每个报告液 5 微升移液到标记的黑色或琥珀色 1 毫升微量离心管中。将溶液转移到黑色 96 孔板上，并用胶箔密封。现在启动成像设备并使用仪器管理器设置参数和曝光时间。将报告板放入设备中，然后将载玻片放入显微镜支架中开始成像。获取染色组织的图像。安装最新版本的数字病理分析软件。单击创建项目，然后选择项目空间的目标文件夹。接下来，单击添加图像，然后单击选择文件。然后导航到由多重免疫荧光成像生成的 QuP TIFF 文件。将图像类型设置为荧光，保留默认设置，然后单击导入。如果使用 QuPath，请双击新图像以打开工作区，然后按“文件”和“保存”定期跟踪项目更改。使用工具栏中的亮度和对比度工具切换标记可见性和查看设置。使用画笔或魔杖工具在整个组织切片周围绘制注释。将此注释定义为完整组织，同时排除不应分析的覆盖皮肤或区域。按住 ALT 键可创建负注释或收缩边界。现在，通过单击“注释”选项卡并按“对象”，然后按“注释”，然后单击“复制所选注释”来选择注释。打开 SOX 10 通道，然后使用 ALT + 画笔/棒工具缩小重复的注释以定义肿瘤区域。现在选择完整的组织注释。然后转到“对象”，然后转到“注释”和“展开注释”。将膨胀半径设置为 1 微米，然后单击运行。将此新注释重命名为“Full Tissue Expansion”。选择肿瘤注释，右键单击，然后选择“在层次结构中插入”。重新选择肿瘤注释，然后转到对象、注释，现在单击反转。将此新注释定义为 Stroma 并对所有组织切片重复此作。要运行单元格分割，请单击“图像”选项卡以查找像素宽度和图像高度。从 GitHub 下载 StarDist 扩展。将 QuPath 扩展StarDist.jar文件导入 QuPath。还可以从 GitHub 下载 StarDist groovy 脚本文件和模型文件。对于每个组织切片，选择肿瘤和基质注释。在设置栏中，单击“自动化”，然后单击“脚本编辑器”以打开脚本界面。打开与图像像素大小相对应的相应 StarDist 细胞分割脚本。出现提示时，选择 StarDistcellsegmodel.pb 进行细胞分割。细胞分割后保存图像，然后依次点击测量、导出测量值，选择相应的图像，并将导出类型设置为细胞，将分隔符设置为.csv。选择输出文件位置，然后点击填充以包含相关指标。对于要用于聚类或表型分析的每个谱系标记，选择一个要导出的平均值。对于蛋白质组学数据的归一化，请打开导出的 CSV 文件并截断列标题以仅保留标记名称。安装最新版本的 R & R Studio 后，从 GitHub 下载标记规范化 .r 脚本并运行它以根据核大小过滤掉单元格。对每个标记执行最小/最大归一化。完成后，保存包含规范化数据的新 CSV 文件。通过蛋白质凝胶电泳确认抗体DNA条形码偶联，在重链区域显示额外的条带。用 4-1BBL/IL-12 纳米颗粒和全身抗 PD1 处理的 B16-F10 侧腹肿瘤的多重免疫荧光成像显示，跨肿瘤切片显示出不同的免疫标志物表达。与修拉表型相比，FlowSOM 聚类识别出更广泛的标记表达强度，最大强度差异约为 0.7 和 0.5。FlowSOM 表型还将更多数量的巨噬细胞分为 M1 和 M2 亚型。巨噬细胞密度的定量表明，与 Seurat 相比，FlowSOM 检测到的 M1 和 M2 巨噬细胞密度更高，而 Seurat 将更多的巨噬细胞归类为其他。空间分析表明，M2巨噬细胞和自然杀伤细胞在治疗后的平均最小距离最高，M1巨噬细胞在CD8 T细胞周围更为普遍。