小鼠 体内 胎盘靶向CRISPR操作

该方案具有重要意义，因为它能够利用CRISPR技术对小鼠胎盘进行时间特异性的靶向操作。这将使研究人员能够阐明妊娠中晚期特定基因的功能。在小鼠胎盘内引起基因过表达的遗传操作极为罕见。

该技术的主要优势在于能够实现胎盘内多种基因表达水平的变化。如果初步尝试该技术未获成功，切勿气馁。由于该技术难度较高，需要投入相当多的时间进行练习才能掌握。

首先，将麻醉后的母鼠仰卧位放置于准备区域，并使用鼻罩维持麻醉状态。彻底剃除母鼠腹部的毛发。为防止角膜干燥，将人工泪胶滴于母鼠双眼表面。

然后使用无菌棉签，以聚维酮碘溶液对手术部位进行至少三轮交替消毒，每轮聚维酮碘消毒后使用70%乙醇，最后再涂布一层聚维酮碘溶液。消毒完成后，将带有麻醉鼻罩的鼠袋移至指定手术区域。进行子宫剖腹手术时，将鼠袋仰卧置于手术台上，并用胶带固定鼻罩位置。

将加热垫放置在吸水垫下方，并调至45摄氏度。通过确认脚趾夹捏反射消失以验证麻醉深度后，使用镊子和剪刀在绷起的皮肤上做一条长约两厘米的正中切口。然后使用无菌镊子将腹膜轻轻提起，远离子宫角，再通过腹膜做垂直切口。

通过用手指按压腹部两侧，按摩两个子宫角以进行引导。将暴露的子宫置于覆盖在下腹部的无菌手术单上，并根据需要滴加温热的无菌生理盐水以保持湿润。子宫暴露后，选取三对胎盘用于操作。

记录胎盘操作的位置以及胚胎在子宫角内的排列情况。对于对照质粒的胎盘注射，使用校准过的微量移液器吸取足量的相应对照质粒，以满足三次注射所需。所有注射均应在蜕膜与连接区之间进行，进针深度约为0.5毫米，横向进入胎盘组织。

注射后、电穿孔前立即用无菌生理盐水涂抹接触部位，使用滴管或注射器将生理盐水精确涂于子宫壁的三个位点以及电极板上。注射后两分钟内，使用连接至电穿孔仪的一对3毫米电极板进行电穿孔。为确保CRISPR的整合效率及胚胎存活率，将参数设置为30伏、30毫秒脉冲、2次脉冲、脉冲间隔970毫秒、单极模式。

轻轻将电穿孔电极板按压在胎盘侧方的子宫壁上。将阳极电极板置于注射部位，阴极电极板置于其正对侧。启动电穿孔仪的脉冲按钮，待两次脉冲完成后再移除电穿孔电极板。

然后按照之前展示的方法进行实验质粒的胎盘注射。在注射后两分钟内，对所有三个注射了实验质粒的胎盘进行电穿孔，操作方式与对照组相同。胎盘操作完成后，仅用手指轻轻按摩子宫角，将其缓慢推回腹腔内。

使用长度为45厘米、带涂层的编织可吸收缝合线，配合13毫米、三八圆弧形针头合金，对腹膜层进行间断缝合。腹膜层缝合完毕后，采用与腹膜缝合相同类型的可吸收缝合线对皮肤进行缝合。缝合完成后，在皮肤缝合处涂抹组织粘合剂。

当组织粘合剂干燥后，关闭蒸发器，并将动物从手术区域转移至背部朝上的支撑笼中。胎盘被注射了通用的 CRISPR Cas9 空载质粒和激活对照 CRISPR 质粒，或 IGF-1 SAM 激活质粒。代表性尸检后图像显示，各处理组均未出现明显损伤或表型外观改变。

未处理胚胎在操作后的产仔中存活率下降至平均79.05%，而操作胚胎的存活率显著降低，平均为55.56%。各组胎盘重量之间无显著差异。手术后母体体重增加与假手术组相比无显著差异。许多妊娠母鼠在术后当天出现轻微体重下降或体重无变化，可能由于手术期间及术后短暂时间内进食受到干扰所致。

大多数母鼠在E14.5时体重增加，但偶尔仍可观察到体重下降。qPCR结果显示，与对照组胎盘相比，IGF-1过表达胎盘中IGF-1的表达显著升高。对E14.5胎盘进行的ELIZA检测显示，与对照组胎盘相比，IGF-1过表达胎盘中的IGF-1蛋白水平显著升高。

绿色自发荧光显示了胎盘母胎界面的亚区域，仅在IGF-1过表达胎盘中观察到红色Cas9标记，表明CRISPR已在胎盘全部三个亚区域成功整合。C2原位杂交荧光标记证实了IGF-1激活质粒的整合，且未向未经处理的胎盘发生迁移。通过Prl8a8染色标记的红色连接区周围，可识别出蜕膜层和迷路区。

请务必记录胎盘及其对应胚胎的操作类型和位置。强烈建议记录子宫角内宫颈以及胚胎的位置。完成此操作后，可对胎盘、胚胎及母体进行分析。

这将有助于更深入地理解基因在妊娠、胎盘功能和胚胎发育中的胎盘特异性作用。