通过多转染技术快速构建细胞状态识别回路
2023年2月24日
复杂的基因回路设计、测试和优化耗时较长。为了促进这一过程，可通过转染哺乳动物细胞，使单个孔内即可测试回路组分的多种化学计量比。本方案概述了实验规划、转染及数据分析的各个步骤。
本方案有助于更便捷、快速地理解生物元件之间的关系。我们可在单个孔中测试多种比率度量组合元件的行为。该技术使研究人员能够比传统方法更全面地表征电路组件之间的复杂关系，同时显著提高实验效率。
该方法适用于合成生物学及各类生物学问题研究，可用于检测细胞在转染不同水平基因后所发生的行为变化，其输出结果可通过流式细胞术进行测量。首先为每种DNA聚集体准备离心管：准备若干1.5毫升微量离心管，并分别标记为无荧光对照、mKO2对照、TagBFP对照、neon green对照、全荧光对照、多转染混合物一和多转染混合物二。向无荧光对照、mKO2对照、TagBFP对照、neon green对照以及全荧光对照管中各加入36微升低血清培养基，然后向多转染混合物一和多转染混合物二管中各加入18微升低血清培养基。
接下来，向无荧光对照管中加入 600 纳克填充质粒，向 mKO2 荧光对照管中加入 300 纳克 mKO2 和 300 纳克填充质粒，向 TagBFP 荧光对照管中加入 300 纳克 TagBFP 和 300 纳克填充质粒。向亮绿色荧光对照管中加入 300 纳克组成型亮绿色荧光质粒和 300 纳克填充质粒，然后向多色对照管中加入 mKO2、TagBFP、组成型亮绿色荧光质粒各 100 纳克以及 300 纳克填充质粒。向多转染混合管一中加入 150 纳克 mKO2、75 纳克报告基因亮绿色荧光质粒和 75 纳克填充质粒。
向第二个多转染混合管中加入150纳克TagBFP、75纳克L7Ae质粒和75纳克填充质粒。完成后，在1.5毫升微量离心管中配制转染主混合液，将216微升低血清培养基与9.48微升转染试剂混合。用移液器反复吹打充分混匀，然后置于一旁备用。
向无颜色对照、单色对照和所有颜色对照管中各加入1.58 µL增强试剂，向每个多转染混合管中加入79 µL增强试剂。用移液器剧烈吹打，分别混匀每管。向无颜色对照、单色对照和所有颜色对照管中各加入37.58 µL转染主混合液，通过剧烈移液混匀。
接下来，向每个多转染混合管中加入 18.79 µL 转染主混合液，并通过剧烈吹打充分混匀各管。使用移液器将每种转染混合液各 65.97 µL 分装至相应的孔中，用于无荧光、单荧光和全荧光对照组；然后将 32.98 µL 多转染混合液一加入多转染孔中，并在平坦表面上以快速而轻柔的紧密画圈方式轻轻摇动培养板，以有效分散复合物；随后再向同一多转染孔中加入 32.98 µL 多转染混合液二，并以相同方式摇动培养板。将细胞孵育两天。
通过流式细胞术检测每个细胞的转染标记物和输出报告基因的荧光信号。一次成功的共转染（与视频中展示的多转染不同）应显示出TagBFP和EYFP之间的高度相关性，这两种质粒被共同递送至细胞内。相反，效果不佳的共转染则表现为两种质粒之间的相关性较差。
成功的多重转染显示出荧光蛋白间二维空间的良好覆盖，以及荧光光谱渗漏的有效补偿。活细胞数量较少的多重转染数据难以划分为足够多的分析区间，且每个区间内细胞数量不足以进行有效分析。转染效率低下的多重转染导致用于分析的二维空间覆盖稀疏。
通过将阻遏蛋白L7Ae与mKO2以及输出蛋白neon green与TagBFP分别置于不同的转染混合物中，检测了输出表达的有效DNA比例。随后在不同水平的mKO2和TagBFP条件下监测neon green的表达。比较了该电路的共转染和多转染结果。
将先前所示DNA元件组合的11次独立共转染实验结果汇总为单一数据集，并与多转染数据进行比较。L7Ae抑制输出报告基因的剂量反应曲线比较显示，共转染与多转染数据在每个浓度区间内的中位输出水平非常相似。研究成功展示了多转染技术在优化细胞类型分类器中的应用。
HeLa细胞中存在而HEK细胞中不存在的micro RNA-21可抑制BM3R1的表达，因为BM3R1会抑制电路输出mKO2的产生。当细胞中存在micro RNA-21时，mKO2的表达将被激活。在BM3R1水平较低的情况下，Gal4-VP16的量可调节mKO2的表达水平。
每种电路组分均与不同的荧光标记物共同递送。这种多转染方法可定量测定每个细胞接收到的各种电路组分的量。mKO2 在 MIR21 中产生，可在 HeLa 细胞中表达，但在 HEK 细胞中不表达。
通过将这些电路组分分别置于不同的转染混合物中，并使用不同的荧光报告基因来指示每个细胞接收到的各电路组分的量，分析了mKO2的输出结果。该次采样预测表明，在此比例下，共转染电路在区分HEK293细胞与HeLa细胞时具有91%的特异性、62%的敏感性和77%的准确率。本方案中最常见的痛点在于各个转染混合物内部缺乏紧密的相关性。
因此，请记住在加入增强试剂后立即剧烈混匀转染管，而在添加含脂质的转染混合物后，则需轻柔地进行混匀和移液操作。本实验步骤中的遗传组分可替换为其他任意遗传组分，以研究其在不同环境中的功能表现。该方法已快速构建出多种遗传回路，例如细胞分类器、反馈与前馈控制器、双稳态基序等。
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概述
该方案通过在单个孔中测试电路组件的多种化学计量比，简化了复杂基因线路的设计与测试。研究人员能够高效地表征生物元件之间的关系及其在不同转染基因水平下的行为响应。
关键研究组成部分
科学领域
- 合成生物学
- 基因工程
- 细胞生物学
背景
- 复杂的基因回路设计与优化具有挑战性。
- 传统方法通常耗时较长且效率较低。
- 流式细胞术可检测转染基因的表达水平。
- 本实验方案旨在提高实验效率。
研究目的
- 便于测试多个基因线路元件。
- 加深对生物元件间关系的理解。
- 实现对线路行为的全面表征。
使用的方法
- 用各种DNA复合物转染哺乳动物细胞。
- 为不同对照和混合物准备微量离心管。
- 使用低血清培养基以获得最佳转染条件。
- 通过流式细胞术测量实验结果。
主要结果
- 在单个孔中高效测试多种化学计量比。
- 更深入理解组分之间的复杂关系。
- 相较于传统方法，实验效率更高。
- 适用于多种生物学问题。
结论
- 该方法简化了基因回路的设计与测试。
- 它能够对回路行为进行更全面的分析。
- 研究人员可以有效探索不同基因水平的影响。
常见问题
行业重要性概要
多转染技术通过在单个孔中同时测试多种DNA化学计量比，实现了哺乳动物遗传回路的快速、高通量优化。该方法通过为细胞状态识别回路提供可预测的置信度和功能靶点验证，加速了“设计-构建-测试”循环，支持早期发现研究。该技术通过为复杂的合成生物学应用提供可靠的定量数据，简化了项目筛选流程。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在哺乳动物细胞中全面解析基因回路组分之间的相互关系。
- 通过量化不同化学计量比例下的回路行为，支持功能性的风险评估与靶点验证。
- 有助于快速验证细胞分类器和调控模体开发中的假设。
- 提供可操作的数据，用于优先选择具有最佳特异性和灵敏度的回路设计。
筛选与检测方法开发
- 为下游筛选工作流程制备经过验证的基于细胞的系统。
- 通过流式细胞术提供可重复的定量结果，实现可靠的检测标准化。
- 支持在单一体系中高通量评估回路性能。
- 支持多组分遗传构建体的可扩展优化，以满足筛选需求。
转化与临床前研究
- 将细胞状态鉴定回路与疾病相关生物标志物对齐，以实现转化连续性。
- 为临床前模型筛选提供定量的特异性、敏感性和准确性指标。
- 降低由回路驱动的细胞分类和功能检测中的机制模糊性。
- 支持对合成生物学资产进行风险调整后推进至临床前验证阶段。
流程与工作流整合
多基因转染技术整合了早期发现与先导识别的界面，能够快速优化遗传回路，以用于后续的转化研究和临床前工作流程。
- 发现生物学：通过将电路输出映射到DNA输入比例，加速假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复、定量的流式细胞术数据，用于评估检测准备就绪状态及平台的重复使用。
- 分析：在单次实验中实现多种条件下电路性能的分组及统计学比较。
- 转化研究：支持将电路输出与疾病相关细胞状态和生物标志物进行关联。
- 企业级复用：提供可扩展、通用的工作流程，用于快速优化多种遗传电路。
运营与企业影响
- 科学价值：提高基因回路优化中的预测置信度，减少机制上的模糊性。
- 操作价值：提供标准化、可重复且可扩展的转染与分析工作流程。
- 战略价值：实现更快速的“推进/终止”决策，推动投资组合的资本高效进展。
- 组合影响：支持对合成生物学资产进行风险调整后的优先排序，以推进后续开发。
实施注意事项
- 需要具备哺乳动物细胞培养、转染及流式细胞术分析方面的专业知识。
- 需要具备高通量流式细胞仪及强大的数据分析基础设施。
- 需要严格执行混匀和移液操作规程，以确保转染混合物之间具有可重复性。
- 可能需要针对不同细胞类型或模型系统调整荧光标记物和回路组件。
- 依赖于足够的转染效率和活细胞数量，以进行可靠的统计学分析。
