利用三维荧光漂白后恢复显微镜分析间隙连接依赖性miRNA转移

本实验的总体目标是研究活体心肌细胞中缝隙连接依赖性的微小RNA转移。该方法有助于阐明微小RNA在细胞间信号传递系统中的作用。该技术的主要优势在于，能够在活细胞中以高时空分辨率对微小RNA的缝隙连接交换进行可视化和定量分析。

根据文本方案分离心肌细胞后，将细胞以每平方厘米3 × 10⁵个细胞的密度接种于6孔板中。于37°C及5% CO₂条件下培养过夜。次日，向细胞中加入0.5 trypzine，孵育5分钟以使细胞脱落。

通过加入细胞培养基终止胰蛋白酶的活性。计数细胞后，在300 × g条件下离心10分钟。然后用电穿孔缓冲液重悬细胞，使细胞浓度为每100 µL含4 × 10⁵个细胞。

接下来，将100 µL细胞悬液与荧光标记的micro RNA在离心管中混合，并将混合液加入电穿孔比色皿中。然后使用电穿孔仪上的G009程序进行电穿孔。加入500 µL预热的细胞培养基，将全部细胞悬液转移至四孔玻璃底培养板的一个孔中。

将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养一天。预热显微镜培养箱并开启共聚焦系统后，将培养皿载玻片插入载物台样品架中。使用1.4数值孔径的油镜，以561纳米激光作为激发光源（低激光功率），检测范围设为570至680纳米，以定位转染的心肌细胞簇。

接下来，在设置管理器中，激活z轴扫描、时间序列、漂白和区域按钮。然后，在采集模式菜单中设置FRAP参数，将帧尺寸设为512×512，线步进设为1，扫描时间设为小于1秒。在通道菜单中，调节激光功率、偏移量和增益设置，以在最低激光激发条件下获得最大荧光信号，避免信号强度饱和。

然后，将针孔大小设置为两微米。接下来，在区域菜单中选择自由绘制工具，使用光标标记目标细胞、参考细胞和背景区域。如有需要，可选择多个目标细胞进行光漂白。

在漂白菜单中，调整光漂白设置。然后，在 z-层叠菜单中，根据细胞的厚度定义 z-层叠采集的范围。将 z 层的数量调整为 12 到 15 层，随后启动 FRAP 实验并记录荧光恢复过程。

为分析数据，使用显微镜专用软件对采集的z轴层扫图像创建最大强度投影：点击“处理”（processing），选择“最大强度投影”（maximum intensity projection），选定文件后应用。最后，将目标区域、背景及参照细胞在所有时间点的荧光强度数据复制到电子表格中，并根据文本方案进行数据分析。图中所示为分离的心肌细胞，具有典型的条纹状α-辅肌动蛋白（alpha actinin）分布，以及沿细胞间边界分布的大片连接蛋白43（connexin43）斑块。

培养物中存在一些非心肌细胞。如流式细胞术结果所示，转染效率达到了45%。此外，活/死细胞染色实验表明，大多数细胞具有较高的存活率，这在分析缝隙连接通讯时非常重要。

进行荧光漂白恢复（FRAP）分析时，在细胞簇中选择目标细胞，并使用100%激光功率进行光漂白，导致所选细胞中的微小RNA荧光减弱。对获取的数据进行定量分析和归一化处理后显示，平均恢复率为20%。在本实验中，通过siRNA介导的connexin43基因敲低导致蛋白表达减少，并抑制了间隙连接通讯。荧光恢复率降低超过50%，表明微小RNA转移效率在很大程度上依赖于细胞间的间隙连接耦合。

该图展示了荧光漂白恢复（frap）实验的三维表面渲染图像。与最大强度投影相比，通过采集z轴层扫数据（z-stacks）可构建三维重建图像，用于研究微小RNA（micro RNA）在细胞内的定位与移动性。一旦掌握实验技术，若操作得当，frap测量可在两到三小时内完成。

在进行该实验操作时，重要的是选择具有相似数量邻近细胞的靶细胞。此外，应选择合适的漂白参数和图像采集条件，以避免光毒性效应。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用FRAP显微技术，对微小RNA在细胞簇内的运动进行定量分析和可视化观察。