一种支持珊瑚精子生物保存与水产养殖的半自动化冷冻保存工作流程

我们的研究计划旨在开发并应用珊瑚的低温保存与生物样本库技术，以保护澳大利亚及全球范围内珊瑚的遗传多样性与生物多样性。珊瑚精子的低温保存技术已有十年的发展历史，但珊瑚产卵仅限于每年的几个夜晚，这使得我们保存濒危物种遗传资源的机会极为有限。我们的目标是优化现有方案，以提高在珊瑚产卵期间低温保存的效率。

我们开发的半自动化处理流程有助于简化珊瑚精子的评估、处理和冷冻保存，从而提高野外样本处理和元数据管理的效率。这有助于我们在有限的生物保藏机会中最大化可冷冻保存的样本数量。本方案易于推广实施，且成本相对较低。

因此，全球的科学家和珊瑚礁管理者均可利用该方法帮助管理珊瑚种群的繁殖与遗传，并支持珊瑚礁修复项目，以防止珊瑚物种灭绝。从雌雄同体珊瑚物种收集配子团以及从雌雄异体珊瑚物种收集精子后，将其放入已标记的50毫升离心管中。取4 µL活化后的精子悬液置于Makler计数池中，以评估活化样本的精子活力与浓度。

打开珊瑚生物库自动数据表文件，输入用于计算机辅助精子分析评估的精子稀释倍数。然后输入计算机辅助精子分析得出的精子浓度、总活力和前向运动活力结果。将精子浓度标注在过滤后的精子样本管上，并将样本管转移至冷冻保存工作站。

打开共享的珊瑚生物库自动数据表，选择“冷冻保存”选项卡。检查精子样本管标签后，通过核对“菌落编号”（Colony ID）找到对应的条目。使用血清学移液管，将精子样本吸入并重新排回同一管中，以测量其体积。将测得数值填入 E 列。查看自动计算的第 1 列，以确定所需的冷冻保护剂浓度，并查看 H 列以获取需添加的冷冻稀释液体积。

启动计时器，使用移液器逐滴加入含DMSO的冷冻稀释液，同时对样品进行持续轻柔混匀。在P列记录冷冻稀释液的添加时间。阅读K列以确定需要填充的冻存管数量。打开无菌条形码冻存管的管盖，并将管盖排列在无菌表面上。

使用血清学移液管和分液移液器，将样品以每份一毫升的量分装至带条形码的冷冻管中，并盖好管盖。在室温下，将一支热电偶管和所有装满样品的冷冻管放入一个空的冷冻架插件中。然后，将装有含10% DMSO过滤海水的空白冷冻管放入冷冻环的空槽中。

将运行编号输入自动数据表的 U 列，并将冷冻架序列号扫描至 V 列。将光标置于 Z 列的正确单元格中，然后依次扫描热电偶小瓶以及所有冷冻小管。将已装载并扫描的架子留置，用于后续的冷冻保护剂平衡步骤。向冷冻架冷却容器中加入液氮，至所需液位，以实现约每分钟负 20 摄氏度的冷却速率。

在完成10分钟的冷冻保护剂平衡后，将热电偶探头连接至数据记录仪并开始记录。轻轻将完整的冷冻架放入冷却容器中，并盖上盖子。在Q列中记录开始时间。当热电偶小瓶在数据记录仪上显示达到-80摄氏度或更低时，立即将冷冻架插入液氮浴中以淬灭样品。

将冻存管从架子上取出，并转移至干式运输罐中，运送到生物样本库。与Makler计数室相比，固定式盖玻片腔室载片在鹿角珊瑚（Acropora millepora）中显示的精子浓度计数不足其一半。使用已知浓度的市售乳胶微珠对Makler计数室进行验证，结果计数一致，且在预期范围内的变异度较低。

使用20%或30% DMSO作为冷冻稀释剂进行冷冻保存的样本，其解冻后总精子浓度、活动精子浓度及前向活动精子浓度之间均未观察到显著差异。