使用单分子定位显微镜绘制细胞核中DNA的绝对密度图

本方法可对细胞核内的DNA绝对密度进行测量，以研究染色质结构中的空间限制，而这些信息通常仅能通过翻译后组蛋白修饰来表征。结合SMLM的Voronoi图分割技术能够以每平方微米碱基对的数量来估算DNA的绝对密度。所需唯一的先验知识是所测细胞核的总DNA含量。

在未来的实验中，研究绝对密度差异是否与其他方法提供的生物学信息相关将十分有意义，例如表观遗传修饰的免疫荧光或 Hi-C 数据。首先，通过拼接预先记录的单张图像来重建扫描区域。打开 CellProfiler，然后加载管道文件 cellcycleanalysis.cpproj。

在流程的第一步中，拖放图像，包括参考图像。接下来，定义参考图像的存储位置。然后单击“启动测试模式”图标，接着单击“运行”。

当显示待分析图像中细胞核的直方图后，确定 G1、S 和 G2 期的荧光强度区间，并确保这些区间已输入至后续的滤波对象步骤中，且这些步骤处于激活状态。然后再次点击“运行”按钮，以继续执行流程的后半部分。观察三幅分别代表不同细胞周期阶段（G1、S 或 G2）的叠加图像，选择处于 G1 或 G2 期的细胞核进行进一步成像，从而获知该图像中细胞核 DNA 的碱基对数量。

将细胞转移至单分子定位显微镜下，并确保FPALM过程中的荧光蛋白正常闪烁。首先，仅使用每层500帧对选定的细胞核进行三维层扫成像。这一步有助于确定中段DNA的相对含量，后续将对该区域用更多帧数成像，以揭示其超微结构。

使用50毫秒的曝光时间开始图像序列采集，获得约每秒20帧的帧率。以200纳米的步进间隔对细胞核进行Z轴层扫，每个光学切片仅采集500帧。完成Z轴层扫后，返回初始的Z轴位置，并以相同的50毫秒曝光时间采集主数据集，共50,000帧。

在 ImageJ 中打开 FPALM 数据集。为了优化闪烁信号的检测设置，请点击 ThunderSTORM，然后运行分析。接着，选择相机设置。

输入图像数据的正确像素尺寸、A/D 计数、所用相机的量子效率、基底水平和 EM 增益，然后点击确定。选择通过拟合闪烁信号来确定定位坐标的算法。在图像滤波部分，使用 B-Spline 小波滤波器，B-Spline 阶数为 3，B-Spline 尺度为 2。然后，将分子近似定位方法设置为局部最大值，将峰值强度阈值和连通性设置为 8-邻域。

在分子亚像素定位部分，方法选择PSF积分高斯法，将拟合半径（px）设为3，拟合方法选择最大似然法，并将初始σ值设为1.6。然后点击“确定”以开始信号检测和图像重建。如果采集数据被划分为不同的图像堆栈，请在ThunderSTORM中拼接定位表。

为此，请在弹出窗口中点击“导入”。确保已启用“追加到当前表格”选项，并使用正确的起始编号，以避免覆盖表格中的定位信息。然后选择文件路径，点击“确定”以逐个导入文件。

为防止在连续帧之间重复计数信号，使用 20 纳米的最大距离、1 帧最大关闭帧数以及每分子 0 最大帧数来合并定位数据，然后点击“合并”。为通过交叉相关数据子部分来测量并校正漂移，请打开漂移校正菜单并点击箭头。添加 3 个区间，并将放大倍数设置为 5。

然后点击“应用”，将出现显示 x 和 y 方向漂移的窗口。为了确定每个切片中与 DNA 含量成比例的信号量（该信号来自预先记录的三维图像堆栈，每个切片包含 500 帧），依次选择“插件”、“ThunderSTORM”，然后选择“导入/导出”，并导入该图像堆栈第一个切片的结果表格。为避免来自三维堆栈其他图像平面的信号被重复计数，需要去除切片之间 z 方向上超出 200 纳米步长间隔的信号。

点击“绘制直方图”，在打开的“分布”对话框中选择 z，然后点击“确定”。确定峰值位置，并使用筛选字段选择光学校准步长为 200 纳米的信号。点击“可视化”，选择“直方图”选项，然后点击“确定”。将生成的图像以 TIFF 格式保存到文件夹中。打开所有切片，然后依次选择“图像”、“堆栈”和“图像合成为堆栈”将其合并。

选择整个图像区域后，进入“分析”菜单，点击“工具”，然后选择“ROI 管理器”。点击“添加”，接着点击“分析”，选择“设置测量”，并勾选“积分密度”。随后，选择“更多”选项，点击“多重复测量”，并勾选“测量所有层面”以及“每层单独一行”。

单击“确定”，结果将显示出来。所有切片强度的总和与整个细胞核的DNA含量成正比，正如各个切片的强度与其在全基因组中所占比例成正比一样。打开包含50,000帧信号的中心平面的结果表后，将其过滤至100纳米的厚度。

创建所得信号的直方图（方法如前所述），并测量中心区域的积分密度。通过运行 MATLAB 脚本 TS2orte.m，将包含中心区域超微结构信息的大型 ThunderSTORM 定位表从 csv 格式转换为 ORTE 格式，该脚本会将定位表转换为 MATLAB 矩阵并以 mat 格式保存。

进入 LAND-voronoi 文件夹，在 coreAlgorithm 子文件夹中打开文件 voronoicluster.m，并根据所使用的细胞类型和细胞周期阶段，调整用于绝对密度计算的 DNA 含量、整个细胞核中观察到的中心区域的 DNA 分数以及定位点数量，以及转换因子。编辑启动分析的脚本 voronoi.m。

调整文件路径以指向 orte 定位数据以及结果文件的输出文件夹。指定定义镶嵌区域的坐标。可在同一输入数据集中定义多个区域进行计算。

运行脚本后，在输出文件夹中查找显示绝对DNA密度的图像，以及其他包含面积分布直方图的图表文件，以及一个包含每个计算出的Voronoi单元密度的densities.m文件。由50,000帧组成的FPALM测量在100纳米厚的中段截面内检测到2.68×10⁶个定位点。

重建图像的定位精度为10纳米。大量的定位点使得在显示绝对DNA密度的同时实现超分辨率成像成为可能。显然，测得的DNA密度在细胞核内并非均匀分布，且覆盖了广泛的动态范围。

细胞核内区域的高倍放大图像显示，较大的 Voronoi 单元表示较低的 DNA 密度，而较小的单元则表示较高的 DNA 密度。在 G1C3H10T 细胞半核中测得的 DNA 密度反映了不同类型和物种细胞核内的绝对 DNA 密度分布。尽管其基本结构类似于早期 G1 期 HeLa 细胞核，但它还额外含有组成型的着丝粒旁异染色质簇。

尽管G2期细胞核的大小略有增加，但其核结构未观察到显著的形态学变化。经TSA处理的HeLa细胞核在核拓扑结构和DNA密度方面表现出显著差异。除显示较高DNA密度岛状区域的周边异染色质外，其余染色质呈现出更加均一且去凝集的状态。