优化的小鼠肠道卷（Swiss Rolls）制备及石蜡包埋组织免疫荧光染色方案

我们的研究重点是理解胃肠道的功能及其在不同病理状态下如何受到影响。我们致力于探究不同肠道上皮细胞在感染和炎症、肥胖以及基因突变等各种条件下所发生的反应。抗体特异性的重要性正变得日益显著。

然而，组织固定、保存以及标准化染色方法的影响在该领域中常被低估。稳定且可靠的免疫荧光染色在很大程度上依赖于组织保存、处理和定位的质量，而这些步骤均发生在数据采集的初始阶段。本方案提供了一种简单且有效的方法，可用于研究有关肠道细胞生物学与生理学的多种问题。

目前，我们的实验室正在使用这些方案来深入理解不同肠道细胞类型在维持稳态和限制炎症中的作用。该方案可在单个石蜡包埋块中实现对小鼠肠道所有区域的详细可视化，从而节省石蜡及石蜡包埋服务的成本，减少切片所需时间以及试剂消耗。

使用多种不同的抗体也具有高度的可重复性。首先，将一个去尖的大号P200移液器吸头连接到10毫升注射器上，并用PBS充满。用镊子将注射器吸头插入已从安乐死小鼠分离出的肠段开口中。

用镊子夹住肠段并将其固定在注射器上，以每秒约 50 µL 的速度轻轻冲洗，以清除内容物。将肠内容物收集到一个空的称量舟中。然后，将湿润的肠段平直地放置在一条干燥且已标记的纤维素滤纸上。

使用解剖剪沿肠系膜缘纵向剪开肠道，每次约剪开5毫米。用剪刀的下刃或一对镊子将剪开的组织平铺在滤纸上。然后，在肠段上方再放置一张滤纸，以防止其在固定过程中卷曲或变形。

为固定组织，用订书钉将滤纸边缘固定，注意避免订到组织本身。将组织浸入10%中性缓冲福尔马林溶液中。轻轻移除接触肠腔面的上层滤纸。

使用镊子小心地将肠道从滤纸的底片上剥离并丢弃。随后，用 PBS 清洗组织三次，以去除组织中的甲醛。使用反向镊子，从短边夹起一段肠道，使腔面朝上，然后转动镊子以卷起组织。

将组织置于干燥的称量舟中。用一只手的镊子固定组织。小心打开反向作用镊子，同时用另一把镊子将组织从反向作用镊子上取下。

将一枚00号解剖针插入组织中。使用金属剪线钳去除针的尖锐部分。待所有样品卷好后，将四个组织卷放入同一个包埋盒中，并将包埋盒放入组织处理仪中。

在包埋台上，将少量石蜡放入模具中。从包埋盒中取出四个瑞士卷，分别放入单独的模具内，尽量平放。再加入更多石蜡以填满模具。

将模具移至冷台，确保所有瑞士卷在模具底部平整。在模具上放置一个带有标签的小型盒盖。待石蜡完全凝固后，从模具中取出蜡块。

首先，准备一个加湿染色盒：取一个大的载片盒，移除粘附在盖子上的纸板盖。将湿润的纸巾垂直放置在载片盒底部，确保其平展。通过脱蜡、复水、抗原修复和洗涤步骤，对载片进行染色前处理。

从 PBS 中取出载玻片，并用纸巾擦去多余的 PBS，注意避免接触组织。使用疏水性笔在组织周围画一个方框，以形成屏障。将画好轮廓的载玻片水平放置在湿润的纸巾上。

加入约 100 微升封闭缓冲液以覆盖组织。关闭湿盒，室温孵育切片 90 分钟。然后轻轻吸去封闭液。

立即将制备好的小鼠抗小鼠封闭液覆盖在组织上，室温孵育15分钟。孵育结束后，从湿盒中取出载玻片，直接放入盛有PBS的染色架中。随后，将载玻片从PBS中取出。

轻轻拍去多余的 PBS，将切片水平放回湿盒中。加入适当稀释的一抗溶液，以覆盖组织。当载玻片从湿盒中取出后，轻轻拍去一抗溶液，将载玻片放入盛有 PBS 的染色架中，浸泡 5 分钟。

从 PBS 中取出载玻片并轻拍去除多余 PBS 后，将其水平放回湿盒中。加入适当稀释的二抗荧光染料或偶联的一抗，覆盖组织。然后，在室温避光孵育前，直接在组织上加入适当稀释的 hoist。

随后，将切片放入盛有 PBS 的新耐溶剂培养皿中，在避光条件下孵育 5 分钟。每次取出一张切片，其余切片保持在避光的 PBS 中浸泡。去除多余的 PBS 后，在组织中央加入一至两滴抗荧光淬灭封片剂。

用镊子夹住干净的盖玻片边缘，以45度角缓慢将其放下，覆盖在载玻片上。从组织中心开始，用两个手指轻轻按压盖玻片。将一支剪去尖端的未过滤P200移液器吸头连接到连接真空泵的血清移液管末端。

沿着盖玻片边缘，使用真空装置吸除多余的封片介质。将载玻片水平放入新的玻片盒中，于室温避光条件下静置干燥。显微图像显示了不同肠段的形态结构，以及杯状细胞、上皮细胞顶膜、侧膜和细胞核的染色情况。

肠道的免疫荧光染色显示了多种不同的细胞区室，包括增殖细胞、间质、溶酶体区域以及上皮组织。