通过富集和测序蛋白质相关新生DNA方法对复制DNA链上蛋白质进行链特异性分析

我们的研究聚焦于表观遗传继承的机制，特别是与DNA复制偶联的亲本组蛋白回收过程，该过程是表观遗传继承中的首个关键起始步骤。已发现多个参与DNA复制的亲本组蛋白沉积因子在亲本组蛋白回收中发挥重要作用。

这包括 D 解旋酶复合物、DNA 聚合酶以及用于保护的复制复合物。传统遗传学和生物化学方法在此研究领域中一直被广泛使用。传统上，高通量测序方法被用于研究亲本组蛋白的传递过程。

在富集和测序与蛋白质相关的DNA之前，研究亲代组蛋白的传递过程具有挑战性。该实验方法为解决这些基本问题提供了强有力的工具。首先，收集酵母细胞沉淀，并通过轻柔涡旋重新悬浮。

然后用含有蛋白酶抑制剂和抗生素混合物的 0.4 毫升 CHIP 裂解缓冲液洗涤沉淀，以防止细菌污染。将混合物在 5,000 G 条件下离心一分钟。接着，向沉淀中加入含有蛋白酶抑制剂和抗生素混合物的 0.1 毫升 CHIP 裂解缓冲液。

加入约 100 微升 0.5 毫米的玻璃珠。在 4 摄氏度冷室中，通过珠磨法裂解细胞，重复三个循环。使用 16 号热针在管底打孔。

将穿刺后的离心管嵌套入一个1.5毫升的空DNA低吸附离心管中，收集裂解液，并在室温下以1,600 ×g离心2分钟。小心吸取上清液，避免扰动沉淀物。细胞碎片部分将含有染色质。

用移液器将0.35毫升添加了补剂的微球菌核酸酶（MNase）消化缓冲液加入细胞沉淀中，重悬细胞。接着，向悬液中加入10单位MNase。轻轻颠倒混匀4至6次，于37°C水浴中孵育20分钟。

加入5微升0.5摩尔的EDTA至终浓度为10毫摩尔，以终止MNase消化反应。轻轻颠倒混匀，将试管置于冰上至少30分钟。使用1.5毫升Bioruptor微管，对反应混合物进行高强度超声处理，总时长3分钟，采用30秒开启、30秒关闭的循环模式。

然后，在 4 °C 条件下以 10,000 G 离心 5 分钟。将上清液转移至新的离心管中，再在 4 °C 条件下以 10,000 G 离心 10 分钟。随后，收集约 400 µL 的上清液。

将30微升保存为DNA提取的输入DNA，并在-20摄氏度下冷冻。使用剩余的370微升细胞裂解液进行组蛋白染色质免疫沉淀。首先，取约150微升先前获得的输入样本和H3K4me3 CHIP样本，置于100摄氏度的加热块上煮沸5分钟，随后立即在冰上冷却5分钟。

然后，向样品中加入上述组分的所需量。在4摄氏度、10转/分钟的旋转条件下孵育样品两小时。将混合物转移至含有20微升经洗涤的蛋白G Sepharose微珠的1.5毫升离心管中。

将混合物在4°C、10 RPM转速的旋转器上孵育突变1小时。在室温下以800 ×g离心1分钟。用1毫升冰冷的溴脱氧尿苷（BrdU）免疫沉淀缓冲液重悬珠子，每次洗涤旋转3分钟，共洗涤3次。

将离心管再次离心，并用一毫升 TE 缓冲液洗涤三分钟。在室温下以 800 G 离心一分钟，小心吸去上清液。向磁珠中加入含有 1% SDS 的 100 微升 TE 缓冲液。

将混合物在 65 摄氏度孵育 5 分钟，然后在室温下以 800 ×g 离心 1 分钟。使用 DNA 纯化柱将上清液纯化至 18 微升洗脱缓冲液中，以获得 BrdU 免疫沉淀和 H3K4me3 eSPAN 样品。根据单链 DNA 及低起始量 DNA 文库制备试剂盒说明书，利用上述样品制备单链 DNA 文库。

将连接产物纯化至20微升低EDTA洗脱缓冲液中。使用单链DNA文库制备试剂盒中的50微升反应混合物扩增DNA文库。按照所示循环程序扩增PCR混合物。

将PCR产物与60微升预热至30摄氏度的磁珠混合，以纯化PCR产物。充分混匀PCR产物与磁珠。室温静置5分钟。

将磁珠置于磁力架上结合3分钟，然后用200 µL新配制的80%乙醇洗涤两次。将磁珠室温干燥2分钟，随后将DNA溶于DNA文库构建试剂盒提供的低EDTA缓冲液中，终体积为20 µL。使用高分辨率电泳系统检测文库浓度及片段大小分布。

将包括输入的H3K4me3染色质免疫沉淀、BrdU免疫沉淀和eSPAN样品在内的各个文库等量混合，以进行平行的成对末端测序。对H3K4me3 eSPAN的DNA测序文库进行凝胶分析显示，呈现出典型的染色质核小体梯状条带模式。主单核小体条带位于270个碱基对处，该位置对应于在DNA片段上添加接头后的长度，而DNA片段来源于酶切消化。

不同样本的定位结果显示，在野生型和 mcm2-3A 细胞中，围绕自主复制序列 607 的单个核小体位置均出现峰信号。平均链偏向性分析表明，在野生型酵母细胞中，亲本组蛋白的沉积略微偏向滞后链；然而，在突变体中，亲本组蛋白 H3H4 被转移至前导链。