G2-seq：一种基于高通量测序技术鉴定基因组晚期复制区域的方法

本实验流程的总体目标是通过对按细胞周期时相进行流式分选的细胞进行深度测序，以鉴定基因组中在细胞周期极晚期才发生复制的区域。该方法有助于回答DNA复制领域中的关键科学问题，例如基因组中哪些区域难以完成DNA复制，因而更容易发生基因组重排。该技术的主要优势在于，尽管其实验操作极为简便，却能够提供关于基因组复制动态的丰富信息。

首先，将目标酵母细胞接种于含有八毫升 YEPD 培养基的 15 毫升试管中。可使用合成培养基或丰富培养基。将细胞在至少 12 小时的过夜培养中生长，以在其真正的对数生长期收集细胞。

次日，当培养物密度达到每毫升500万至1500万个细胞时，离心收集细胞，并将其重悬于1.5毫升70%乙醇中。随后将悬液转移至1.6毫升微量离心管中，室温孵育1小时，或冰上孵育至少3小时。接种后，离心收集细胞，并将其重悬于1毫升柠檬酸钠溶液中。

最后，短暂超声处理细胞两次。然后重复离心步骤，并将酵母重悬于1毫升含RNase的柠檬酸钠溶液中。将RNase与酵母在50摄氏度下反应1小时，或在37摄氏度下过夜，可使用加热块或水浴进行。

RNase 处理后，向混合物中加入 50 微升蛋白酶 K 溶液，在 50 摄氏度下继续反应 1 小时。然后离心收集细胞，并将细胞重悬于 1 毫升柠檬酸钠溶液中。接着离心细胞，并用真空泵吸除上清液。

然后在弱光条件下，将细胞重悬于1毫升含绿色核酸染料的柠檬酸钠溶液中。接着将酵母在室温下避光孵育1小时。接下来，使用细胞分选仪，根据530纳米发射光数据对细胞进行计数。

根据其DNA含量将细胞按细胞周期时相分为G1期、S期、早期G2期和晚期G2期。从每个时相中收集至少160万个单倍体细胞。分选细胞后立即以20分钟离心沉淀细胞，吸除上清液，并将细胞沉淀在-20摄氏度下冷冻保存。

我们发现，该实验流程中最关键的一步是在收集细胞后尽快离心沉淀细胞，分选后最多不超过一小时。该提取方法基于酵母基因组DNA提取试剂盒。首先加入120微升消化缓冲液和5微升酵母裂解酶。

然后使用涡旋振荡器将细胞混入反应混合物中，在37摄氏度下孵育40至60分钟。接着加入120微升裂解缓冲液，高速涡旋振荡10至20秒。然后加入250微升氯仿，充分混匀管内物质1分钟。

接下来，以最大速度离心管子两分钟。然后将上清液转移至DNA结合柱上。使用一分钟最大速度的离心步骤，使上清液通过柱子。

为了清洗柱膜上的DNA，将柱子转移到新的收集管中，并加入300微升DNA洗涤缓冲液。然后以最大速度离心一分钟。再重复此洗涤步骤一次。

为收集 DNA，将离心柱转移至新的离心管中。加入 60 µL 水，静置 1 至 3 分钟。然后以最大速度离心 10 秒，以收集含有洗脱 DNA 的水溶液。

现在加入5至195微升含有试剂的双链DNA高灵敏度缓冲液，试剂浓度为1:200。然后测定样品的荧光值以计算得率。预期可获得10至50纳克的DNA。

现在使用超声处理将DNA打断成250至350个碱基对的片段。然后使用标准试剂盒构建DNA文库，并进行测序，测序要求至少1000万条50个碱基对的单端读长。上述方法已被用于鉴定芽殖酵母中的晚期复制位点。

将正常细胞与缺乏去乙酰化酶蛋白Sir2的细胞进行了比较。原始数据中存在大量尖峰，主要由TY元件的存在引起。通过将每个样本的测序深度限制在其中位数测序深度的2.5倍以内，去除了这些尖峰。

去峰后的数据随后使用20 kb的滑动窗口进行平滑处理。最后，数据经过标准化，并以G1期水平的比值形式绘图。完全未复制的细胞比值为0.5，而完全复制的细胞比值为1。在来自7号染色体的这些数据中，可见Sir2突变体中已知的晚期复制区域的证据。

观看本视频后，您应能充分理解如何鉴定基因组中最后完成 DNA 复制的区域，这些区域由于复制时间较晚，特别容易发生 DNA 断裂及其他相关问题。