从小鼠脾组织中分离和表征外泌体

组织来源的外泌体因其能够准确反映组织特异性和微环境而受到越来越多的关注。本研究旨在阐明脾脏来源外泌体在心血管疾病中的基础与转化作用。在本研究中，我们建立了一种从小鼠脾脏组织中分离外泌体的实用方案，为后续的鉴定分析和功能研究提供了可重复的技术方法。

我们采用I型胶原酶进行消化，随后通过差速超速离心过滤，以获得高质量的脾脏外泌体。与以往使用组织匀浆法获取组织悬液的方法不同，本方法能够保持组织中细胞的膜完整性。该技术在研究外泌体在免疫应答中的作用时可能尤为有用。

鉴于脾脏在免疫系统中的关键作用，未来的研究可将本方案改进后应用于人体组织，从而提取具有临床意义的外泌体用于诊断和治疗目的。首先，将高速及超高速离心机预冷至4°C，并将台式摇床温度设置为37°C。准备直径为100毫米的细胞培养皿。

然后，准备好50毫升无菌离心管、冰和孔径为70微米的无菌细胞筛。用75%酒精喷洒剪刀和镊子进行消毒，并用高温加热进一步灭菌。接着，将脾组织置于冰上的一只无菌100毫米培养皿中，并用预冷的1×PBS冲洗掉表面血液。

用无菌纱布彻底擦干脾脏后称量组织。接着，使用无菌移液管向70微米细胞筛中加入1毫升PBS以润湿筛网。最后，用涡旋混合器将0.1% I型胶原酶溶于1× PBS中，配制消化缓冲液。

首先，准备好组织处理所需的试剂和无菌工具。用剪刀在冰上的培养皿中将脾脏组织剪切成小而均匀的碎片，然后使用无菌移液管将其转移至一个 50 毫升离心管中。随后，根据脾脏组织的重量向管中加入消化缓冲液，并将离心管置于设定为 37 °C 的水平摇床中，以 45 度角振荡。

当组织块已分散且大部分碎片失去原有形态时，停止消化。在室温下将消化后的混合物通过70微米细胞滤筛，以去除纤维状物质和较大的组织碎片。将滤液收集至新的50毫升离心管中。

在4 °C条件下，将滤液以500 ×g离心10分钟。然后将上清液转移至新管中，并在适当转速下重复离心步骤。超速离心后，弃去上清液，并用PBS洗涤沉淀。

再次在4°C条件下以120,000 G超速离心两小时，以分离外泌体。最后，将分离得到的外泌体溶解于每脾200微升无菌PBS中，并置于2毫升离心管中于-80°C保存。透射电子显微镜图像显示存在具有脂质双分子层的杯状囊泡，这是外泌体的典型特征。

外泌体大小范围为30至150纳米，粒径分布图显示其峰值浓度位于60纳米。Western印迹分析证实存在外泌体标志物TSG101和CD9，而未检测到GM130及阴性对照。