使用单分子磁镊分析端粒蛋白- DNA 相互作用

单分子方法已被用于研究端粒蛋白与DNA的相互作用。然而，构建含有端粒重复序列的单分子体系仍是一项具有挑战性的任务。在本方案中，我们概述了表达并纯化TRF2蛋白、制备端粒DNA、建立单分子力学实验以及分析所得数据的各个步骤。

单分子技术是研究端粒蛋白与DNA相互作用的有力工具。单分子力学方法，如磁镊、光镊和原子力显微镜（AFM），已被用于研究TRF2依赖的DNA形变，揭示TRF2介导人端粒染色质形成柱状堆积结构，并观察端粒酶催化活性等多种应用。我们采用单分子磁镊技术研究端粒DNA与蛋白质的相互作用，能够在施加外力的条件下，精确测量蛋白质与DNA相互作用过程中DNA长度的变化。

通过这些测量，我们推导出了端粒DNA-蛋白质复合物的解离动力学。此外，还揭示了这些复合物内部环状结构的形成。目前已利用冷冻电镜、X射线晶体学和核磁共振技术解析出大量端粒结合蛋白与DNA复合物的结构。

这些结构方法推动了我们对端粒蛋白与DNA相互作用的理解。为了进一步研究这些相互作用的动力学特性，我们开发了一种专门用于起始端粒蛋白与DNA相互作用的单分子力学方法。单分子技术是研究端粒酶中蛋白与DNA相互作用的有力手段，尤其适用于蛋白质拓扑构象的确认以及蛋白-DNA结合与解离动力学的分析。

开始转化大肠杆菌BL21 DE3细胞时，将50微升感受态细胞悬液置于冰上解冻。向感受态细胞悬液中加入1微升pET28a-SUMO TRF2质粒DNA，轻轻涡旋混匀。转化完成后，取100微升细胞悬液涂布于含有50微克/毫升卡那霉素的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上。

将细胞在37摄氏度下孵育过夜。次日，挑取转化细胞的单菌落，接种于5毫升含有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基中进行培养。在37摄氏度、220转/分钟振荡条件下孵育18小时。

孵育后，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1毫摩尔/升，以诱导培养物表达。在20摄氏度下孵育17小时，以促进蛋白表达。将粗蛋白提取物与上样缓冲液一起上样至SDS-PAGE凝胶中。

首先在Tris-甘氨酸缓冲液中以100伏电压运行样品30分钟，随后以120伏电压运行50分钟。然后使用考马斯亮蓝染色以观察蛋白质表达。进行蛋白质纯化时，将粗蛋白提取物在4摄氏度下以38,000G离心40分钟，并通过0.22微米注射器滤膜过滤上清液。

将过滤后的上清液加入已用结合缓冲液预平衡的镍柱中。用结合缓冲液洗涤柱子，并用预先配制的咪唑梯度稀释蛋白，收集12个组分，每管1毫升。向浓缩并置换缓冲液后的蛋白中加入甘油，使其终浓度为50%，用于储存。

通过SDS-PAGE分析成功证实了TRF2在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达，结果显示在诱导前和诱导后均出现对应于TRF2的明显条带。首先，将含有端粒限制性片段DNA的1×10⁷个HeLa细胞系在1,000×g下离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µL PBS中。

经SDS、蛋白酶K和氯化钠处理后，将细胞悬液在16,900 × g离心10分钟。将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，避免混入漂浮的脂质或沉淀物。高速离心后，用500 µL 70%乙醇洗涤沉淀。

干燥DNA沉淀后，小心地将其重悬于475微升TE缓冲液中，并通过轻弹管底轻轻混匀。然后加入25微升浓度为10毫克/毫升的RNase A，轻弹管壁直至沉淀完全溶解。接着加入1/10体积的3摩尔醋酸钠和两倍体积的预冷100%乙醇，将离心管置于-80摄氏度环境中冷冻2至3小时。

离心并用70%乙醇洗涤后，向DNA沉淀中加入100微升TE缓冲液。轻弹管壁混匀，置于4摄氏度环境中两小时，使其充分溶解。进行DNA消化时，将4微克基因组DNA与1微升CVIA 2、2微升10倍消化缓冲液及适量水混合，总体积为20微升。

将混合物在25摄氏度下孵育12小时。在热循环仪中，将混合物于75摄氏度加热3分钟，随后每30秒降低温度0.1摄氏度，直至达到25摄氏度。清洁并干燥后，用20微升0.1%硝酸纤维素涂抹底部盖玻片，并加入参考微珠。

将盖玻片在 100 摄氏度下烘烤 4 分钟。组装流动池夹心结构，加热至 85 摄氏度后，用两根棉签轻轻按压组件，直至石蜡膜完全密封通道。使用磁铁将 10 微升 M270 磁珠用 50 微升工作缓冲液洗涤 5 次。

洗涤后，将珠子加入到已消化的基因组DNA上，转移至1.5毫升离心管中。轻轻弹动离心管数次，以混匀珠子与DNA样品。将混合物置于冰上孵育1小时。

孵育后，使用磁铁将磁珠沉降，每次用500微升工作缓冲液洗涤，共洗涤三次，每次间隔10分钟。将样品重悬于工作缓冲液中，取30微升混合物加入流动池。30分钟后冲洗未结合的磁珠。

将流动池放置在物镜上方后，选择一对呈垂直排列的5毫米立方磁铁，并将磁铁支架与磁镊光路的X轴对齐以进行成像。启动图形化编程软件，连接磁镊控制器。调节视野以定位流动池底部的一个参考微球，并轻微调整物镜位置，使参考微球呈现出清晰的衍射环。

编写一个 MATLAB 脚本以控制力斜坡实验中的电机运动。将该脚本导入图形化编程软件，用于测试单分子实验。在较低流速下，向流动池中加载 200 微升浓度为 10 纳摩尔的 TRF1。

结合30分钟后，选择一个力斜坡实验的程序，设置力加载速率为正负一皮牛顿每秒。命名数据文件并运行实验。通过琼脂糖凝胶电泳确认基因组DNA的完整性，结果显示不同人类细胞系中的TRF长度一致。

通过Southern印迹法检测到TRF中的端粒重复序列，显示出清晰的杂交信号。力-伸展曲线在力程实验中拉伸时呈现锯齿状模式，表明蛋白质与DNA相互作用的断裂。端粒DNA-蛋白质复合物的解离动力学显示，作用力与解离速率之间存在线性关系。

此外，通过研究人类细胞中端粒DNA的长度异质性，可探讨不同长度端粒中的环状结构形成机制。