使用 R、Seurat 和 CellChat 分析小鼠皮肤伤口愈合的单细胞转录组数据集

在我们的实验室中，我们结合单细胞转录组学、空间转录组学以及系统生物学和生物信息学方法，研究不同愈合结局中的时空细胞动态。近年来，单细胞转录组学在人类及模式生物（如小鼠）伤口愈合研究中的应用迅速增加。然而，对于缺乏或仅有少量生物信息学经验的实验科学家而言，单细胞数据集的完整分析具有较高门槛。这意味着在伤口愈合领域，科学家们往往未能充分利用单细胞数据集。本方案是首个无需任何生物信息学先验知识的综合性实验流程，可引导用户从数据集下载开始，逐步完成与伤口愈合研究相关的各类分析并获得结果输出。本方案可作为伤口愈合研究人员深入分析自身单细胞数据集的模板，同时帮助他们从公开可用的数据集中挖掘新的科学见解。

[Shalyn] 首先，使用编号 GSE204777 从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus）中访问数据集文件。点击标题为 GSM6190913 的第一个数据集。滚动至 GSM6190913 页面底部，通过 FTP 或 HTML 链接下载列出的三个文件。使用计算机的文件资源管理器，将下载的文件移至名为 b1 的目录中，并确保该目录位于工作目录内。获取已下载的单细胞测序文件的目录路径信息。接下来，将单细胞测序文件加载到工作环境中。然后，从工作数据集中分离基因表达数据和多重检测 HTO 数据。使用基因表达数据创建 Seurat 对象，同时过滤掉在少于五个细胞中被检测到的基因，以及基因数少于 200 的细胞。对于缺乏 HTO 数据的数据集，使用相同的过滤参数创建 Seurat 对象，并切换至基因表达检测。计算每个细胞中线粒体基因所占百分比，并将该值作为元数据变量进行赋值。可视化所有细胞中基因计数、总 RNA 量以及线粒体基因百分比的分布情况。使用阈值去除线粒体含量超过 25% 的细胞，并在剔除这些低质量细胞后重新可视化更新后的分布。使用 SC doublet finder 方法检测可能的双细胞（doublets）。运行 SC doublet finder 分析流程，将生成的双细胞评分作为新的元数据变量进行赋值。现在，可视化所有细胞中双细胞评分的分布情况。剔除双细胞评分高于 0.25 的所有细胞，并将清洗后的 Seurat 对象以 RDS 文件格式保存至工作目录中。执行数据归一化、标准化及主成分分析（PCA）。可视化前 50 个主成分的方差贡献情况。使用前 13 个主成分和聚类分辨率为 0.1 的参数对细胞进行聚类。在邻近性分析中执行均匀流形近似与投影（UMAP）降维，使用前 13 个主成分，并将随机种子数设为 123。现在，在 UMAP 图上可视化细胞聚类结果，随后在另一张 UMAP 图上展示伤口时间和空间注释。接着，生成一个表格，将细胞聚类与伤口时间和空间注释相关联。在计算所有聚类之间的差异表达基因后确定主要细胞类型身份，并将得到的差异表达基因（DEG）列表赋值给变量，随后以分隔符文本文件格式保存至工作目录。现在，在电子表格应用程序中打开数据集聚类标志物文件。使用文本导入向导将逗号设置为分隔符，并将基因名称列格式化为文本，以防止基因名称被自动转换为日期。在电子表格中，将“平均 log2 FC”列按从大到小排序，使行按 log2 倍数变化值递减顺序排列，接着将“cluster”列按从小到大排序。为使行按 Seurat 聚类编号升序排列，首先筛选“平均 log2 FC”列，仅保留大于或等于 2.5 的值，然后筛选“PCT 1”列，仅保留大于或等于 0.4 的值。接下来，筛选“PCT 2”列，仅保留小于或等于 0.2 的值。最后，筛选“P-value adjusted”列，仅保留小于或等于 0.01 的值。现在，打开基于网页的富集分析工具 Enrichr。针对每个聚类，将差异表达基因列表分别复制到独立的 Enrichr 窗口中并点击“analyze”。然后，点击分析结果上方的“cell types”标签，重点关注三个精选细胞标志物数据库中排名前五的富集结果。根据 Enrichr 分析中获得的最高富集结果，为八个聚类分配可能的细胞身份。将聚类 2 和聚类 6 合并为一个标注为“成纤维细胞（fibroblasts）”的类别，并将这些标注作为名为“cell types”的新元数据变量进行赋值。随后，在 UMAP 图上可视化标注后的细胞类型，并在一系列 UMAP 图上展示加粗显示的顶级聚类标志基因的定位情况。在点图（dot plot）中按原始聚类编号分组展示顶级聚类标志差异表达基因，然后再次在点图中展示这些顶级标志基因，但此次按标注的细胞类型分组。为进行时间序列分析做准备，移除空间注释并对数据集进行简化。将伤口时间和空间元数据重新赋值为一个名为 DPW（Days Post Wounding，伤后天数）的新变量。在 UMAP 图上可视化新的 DPW 时间序列分组，并生成表格，展示每个 DPW 组中各类细胞的数量。接下来，将细胞计数转换为比例，以评估愈合过程中细胞类型组成相对变化情况，并可视化每种细胞类型内各 DPW 类别的比例分布。最后，可视化每个 DPW 组中各类细胞的比例，并将包含所有注释和过滤信息的最终 Seurat 对象以 RDS 文件格式保存至工作目录。数据集中所有细胞在 UMAP 图上均清晰聚类为不同颜色编码的主要细胞类型，证实了基于富集细胞类型特征的成功注释。顶级聚类标志基因的高表达在 UMAP 图上定位于其对应的细胞类型聚类区域内。点图可视化结果进一步确认，聚类标志基因的最高表达水平仅局限于其标注的主要细胞类型中。堆叠柱状图显示，在伤后第 1 天，中性粒细胞和巨噬细胞占主导地位，而在后期时间点，成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞的比例逐渐升高，反映了已知的伤口愈合细胞级联过程。