高通量成像与分析工作流程用于评估组织样本中皮肤细胞表型及增殖状态

本方案结合多重光学成像方法 IBEX 与 Click-iT EDU 标记技术，用于检测并分类皮肤修复等高度动态过程中的分裂细胞类型。此外，我们提供了一种新颖的开源成像处理流程，用于高通量图像的采集与分析。用 200 µL 铬铝明胶包被 24 孔板，并将该板置于摇床振荡器上孵育 15 分钟。

然后彻底去除明胶，并将包被的孔板在40摄氏度烘箱中干燥60分钟。在低温恒温切片机上将OCT包埋的组织切成15至30微米厚度，并迅速转移至含有2毫升PBS的包被孔板中。使用1毫升移液器小心吸除PBS，注意保持组织切片位于孔板中央。

为有效完成此操作，从孔板边缘缓慢吸出 PBS，根据需要调整移液器位置，以防止组织移位。将组织切片置于 37 摄氏度烘箱中干燥一小时。加入一毫升 PBS 重新水化，持续五分钟。

在室温下用 500 微升 0.5% Triton 处理组织 30 分钟以进行通透。用 PBS 短暂洗涤组织两次，然后在室温下进行 Click-iT 反应 30 分钟。样品需避光保存。

用 PBS 短暂洗涤组织两次。在室温下用封闭缓冲液封闭一小时。加入第一轮循环的一抗。

在4°C下将酶标板孵育过夜。用PBS洗涤三次。进行二抗染色。

第一个循环中，将未配对的一抗对应的二抗与核复染剂共同孵育。室温下避光孵育60分钟。室温下用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤组织三次，每次五分钟。

每个孔中保留约 500 微升 PBS，并将培养板移至显微镜下。在 Meta Express 软件中，点击“筛选”，然后选择“采集设置”。点击“弹出”按钮。

用70%乙醇清洁培养板底部，并将培养板插入显微镜。单击“加载培养板”按钮。在“物镜与相机”选项卡中，选择所需的放大倍数。

选择共聚焦51微米狭缝模式作为采集模式。在“板”选项卡中，选择板型号。进入“板位访问”选项卡。

在“站点选项”中，点击固定站点数量。设置列数和行数，使覆盖整个孔的大致区域。将重叠站点设为10%。通过在孔板图上右键单击相应孔，仅选择第一个孔进行采集。

转到采集自动对焦选项卡。对于孔间自动对焦，选择“板”和“孔底”选项。对于位点自动对焦，选择“所有位点”选项。

转到“波长”选项卡，选择在当前循环中要成像的染料数量。进入第一个波长选项卡，选择带有Z偏移的激光用于Z轴定位，然后单击“计算偏移”按钮以设置正确的成像高度。

选择样本最清晰对焦的图像。按下对焦按钮。将显示组织的清晰对焦图像。

将照明功率设置为50%，将目标最大强度设为2000，然后按下自动曝光。对于Z系列图像，选择Z系列和2D投影图像；对于阴影校正，仅选择荧光阴影校正。对其他波长重复上述步骤，但不再选择带有Z偏移的激光，而是从W1中选择Z偏移，并将其设为零。

转到Z轴步进设置，输入所需的步长。单击“聚焦”按钮。拖动当前位置箭头，直至到达组织底部，然后单击“设置B”按钮。

将位置箭头拖动至组织顶部，然后点击“设置T”按钮。点击F2，停止，再次按下“开始实时”按钮。通过左键单击确认载物台位于第一个孔中。

找到组织的边界，通过右键单击标记所有含有组织的采集位点。转到“运行”选项卡并输入培养板的名称。点击“保存方案”。

为所有其他孔设置采集区域。按“控制”、“日志”、“开始记录”，然后立即按“控制”、“日志”、“停止记录”。保存所创建的日志，并通过“控制”、“日志”、“编辑日志”重新打开。

在左侧面板中，进入“板获取”界面，从文件加载协议，然后点击“板获取”以将这些步骤添加到日志中。双击“编辑板获取”，从文件加载协议，并选择为第一个孔保存的协议。对需要获取的每个孔重复上述步骤，确保始终加载对应的协议。

单击“运行期刊”以开始采集。在期刊结束前30分钟，开始准备漂白试剂。将10毫克硼氢化锂溶解于10毫升重蒸馏H2O中，并通过0.22微米滤膜过滤。

静置10分钟，溶液应开始产生气泡。为确保漂白效果，漂白试剂应在配制后4小时内使用。

将漂白液加入样品中，在环境光照条件下孵育15分钟。组织上应出现少量气泡。用1毫升PBS在室温下洗涤漂白后的样品，每次5分钟，共洗涤三次。

加入下一循环的一抗，并在4°C下孵育过夜。多重IBEX成像结合Click-iT EDU标记可揭示损伤皮肤中不同的结构及增殖性细胞类型。在冷冻保存样本上进行的EDU标记显示，其结果与在石蜡包埋组织切片上进行KI-67抗体免疫荧光标记，以及通过流式细胞术使用KI 67标记细胞的结果相似。

采用本方案可准确检测复杂生物过程中的细胞增殖。此外，该开源图像处理流程无需任何编程经验，且生成的文件可用非商业软件（如 Fiji 和 quPath）进行处理。进一步地，本方案无需任何昂贵设备，因此可在大多数研究环境中实施。