共聚焦显微镜分析蛋白质向胞间连丝的分选 Nicotiana benthamiana

我的研究聚焦于植物中物质在细胞间的多种运动方式，我正致力于理解感染后局部扩散过程中植物各种相互作用的机制。最近，我们发现胞间连丝可能允许蛋白质复合物在烟草本塞姆氏变种（nicotiana benthamiana）的细胞间移动。这些结果将有助于我们未来深入理解胞间连丝的功能机制。

了解蛋白质的亚细胞定位对于研究其功能非常重要。本实验方案提供了定位于胞间连丝的良好标记蛋白 PDLP5 和 TVCV MP，可用于蛋白质定位研究。首先，在受控环境培养箱中，将烟草本氏烟草（nicotiana benthamiana）种子种植于湿润土壤中，设置温度为 23°C，保持每日 16 小时光照，随后 8 小时黑暗。

将两周大的幼苗转移至较大的花盆后，在相同条件下继续培养4至5周，以准备进行农杆菌浸润实验。将含有目的载体的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105菌株划线接种于LB琼脂平板，于28摄氏度培养。两天后，从平板上挑取单菌落接种至2毫升LB液体培养基中，于28摄氏度、250转/分钟振荡条件下过夜培养。

然后，从过夜培养物中取出一毫升，加入四毫升新鲜的LB肉汤，在相同条件下重新培养一小时。通过离心收集细胞沉淀。随后，在600纳米处测定细菌悬液的菌体密度，并使用浸润缓冲液将光密度调整至0.1或0.2。

将细菌悬液在室温下轻轻振荡孵育三小时。随后，使用1毫升无针一次性注射器，从不同植株的完全展开叶片的远轴面进行浸润。用防水笔标记浸润区域，该区域将比周围未浸润的组织颜色更深。

首先，获取经携带目标载体的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片。为观察胞间连丝，取200 µL的1% 茴香蓝溶液滴加至显微镜载玻片上。然后，使用刀片将侵染区域从叶脉处切下，并将切下的叶片组织以远轴面朝上的方式转移至载玻片上的茴香蓝溶液中。

确保叶片组织样本完全浸没后，再盖上盖玻片。将带有样本的载玻片放入连接真空泵的干燥器中。在低于0.8帕斯卡的条件下抽真空两分钟。

然后，缓慢释放压力，并将载玻片在室温下避光孵育30分钟。接着，在激光扫描共聚焦显微镜下观察苯胺蓝的荧光信号。首先，获取经携带目标载体的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）植株。

进行蛋白质定位研究时，在侵染后的不同时间点，从两株植物上各采集两片叶片。用刀片将侵染区域避开叶脉切成小片。将组织样本背面朝上放置在载玻片中央的一滴无菌水中。

用盖玻片覆盖载玻片，确保无气泡残留。使用激光扫描共聚焦显微镜观察浸润区域中自荧光标签的荧光信号。每种条件下采集至少20张图像，并确保至少进行两次独立的生物学重复实验。

根据信号在细胞边缘呈现的特征性点状分布，对受试蛋白的胞间连丝定位情况进行评分。TVCV MP-EGFP 和 PDL5-EGFP 蛋白均表现出清晰的胞间连丝点状定位。而在浸润后第一天，PDCB1-EGFP 蛋白同时定位于胞间连丝和内质网；自浸润后第一天起，MP 和 PDLP5 均开始在胞间连丝处积累，至第二天达到最强荧光强度，并在随后五天内保持稳定。

PDCB1 在前三天表现出强烈的内质网定位，此后，胞间连丝定位在较少的细胞中变得可见。