使用杜仲（Eucommia ulmoides）树皮提取物制备锌基纳米材料及其伤口愈合潜力

我们的研究致力于揭示生物工程金属纳米颗粒在伤口愈合中的潜在应用。我们旨在阐明这些纳米颗粒如何影响愈合过程及其作用机制，以解答其在组织修复中治疗应用的关键问题。我们已成功开发出多种基于天然聚合物的纳米伤口敷料，证实了其在多种伤口愈合应用中的潜力，并推动了组织修复领域的创新方法。

本研究将有助于在体内模型中识别潜在的作用机制，并推动开发具有生物相容性特性的伤口愈合材料，从而提高其在多种医学应用中的有效性和安全性。首先，用剪刀将从杜仲（Eucommia ulmoides）树上采集的树皮剪成小块。用双蒸水将剪碎的树皮材料清洗两次。

然后，在避光条件下于37摄氏度干燥树皮碎片24小时。将20克避光干燥的树皮转移至含有220毫升无菌双蒸水的锥形瓶中。随后，将锥形瓶在130摄氏度加热20分钟。

注意，溶液在10分钟后颜色变为浅黄色。随后，将含有聚异戊二烯的粗提物于4摄氏度保存，以供后续使用。形成丝状结构表明提取物中含有聚异戊二烯。

将一摩尔的硝酸锌二水合物加入50毫升去离子水中，置于500毫升锥形瓶中。使用磁力搅拌器以60转/分钟持续搅拌，直至硝酸锌二水合物完全溶解。然后，将15毫升杜仲树皮提取物逐滴加入20毫升一摩尔的硝酸锌二水合物溶液中。

将覆盖的反应混合物置于磁力搅拌器上。打开搅拌器，设定搅拌三小时。随后，逐滴加入1 N氢氧化钠溶液，调节反应混合物的pH至9。

加入氢氧化钠直至溶液变为乳白色，同时保持 pH 值低于 9，表明已形成氧化锌纳米颗粒。然后将合成的杜仲氧化锌纳米颗粒转移至 50 毫升离心管中，在 4 摄氏度条件下以 100 ×g 离心 5 分钟。将洗涤后的杜仲氧化锌纳米颗粒收集于玻璃板上，并在热风烘箱中于 45 至 50 摄氏度干燥 1 小时。

首先，在96孔板的每个孔中接种1×10⁴个人脐静脉内皮细胞。将该板置于设置为5%二氧化碳和37°C的培养箱中。进行细胞毒性评估时，向90%融合的细胞中加入10 µL不同浓度的杜仲氧化锌纳米颗粒。

将培养板置于含5%二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下孵育24小时。孵育结束后，小心移除旧培养基，避免扰动细胞。向每孔中加入10 µL CCK-8溶液（每孔预先含有90 µL新鲜DMEM培养基），然后按照前述条件进行孵育。

然后，使用分光光度计在450纳米处测定经CCK-8溶液处理的细胞的吸光度。在含有DMEM（添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）的12孔培养板中接种1×10⁵个人类脐静脉内皮细胞。将培养板置于设定为5%二氧化碳和37°C的培养箱中。

使用无菌的 200 微升移液器吸头在细胞单层上轻轻划一道划痕，形成宽度为 200 微米的代表性伤口。从孔中移除完全培养基后，用 1 毫升 PBS 轻柔洗涤单层细胞，以去除脱落的细胞。随后，将含 10% FBS 的完全培养基与浓度分别为 0、10 和 20 微克/毫升的杜仲锌氧化物纳米颗粒溶液混合后加入各孔中。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育。使用倒置显微镜在0小时和24小时获取划痕伤口的显微照片。使用此处所示公式计算伤口闭合的百分比。

杜仲氧化锌纳米颗粒在浓度高达每毫升50微克、作用24小时的条件下，对人脐静脉内皮细胞无细胞毒性。经每毫升20微克杜仲氧化锌纳米颗粒处理的细胞，伤口闭合显著增强，24小时后闭合率达到81.5%，而对照组仅为16%。显微图像显示，与对照组相比，每毫升20微克处理组在24小时后伤口间隙宽度减小。