开发一种用于研究缺氧耐受性的甘蓝原生质体系统 芸薹属

我们正在研究卷心菜在分子水平上对低氧的反应。由于获取完整的卷心菜较为困难，我们正在开发一种利用分离的卷心菜细胞的系统。通过将这些游离细胞（也称为原生质体）暴露于低氧环境中，可以方便地研究其应激反应。

利用悬浮在溶液中的原生质体研究低氧响应具有挑战性。主要难点在于如何为对照样品维持足够的氧气。我们开发了一种方法，可将液体中的氧气抽出。

我们通过缺氧标志物的报告基因检测验证了该方法。我们测试了多种处理低氧条件的方法，发现氧气吸收剂包装效果最佳。该方法使用简便且高效，非常适合研究原生质体在低氧环境中的行为。

由于可用工具的限制，在低氧条件下研究叶类作物的分子机制一直具有挑战性。但随着近期技术的进步，我们通过采用经低氧处理的甘蓝原生质体系统，已取得了显著进展。这一新方法有助于我们理解低氧如何在分子水平上影响这些植物。未来，我们计划将原生质体系统与免疫沉淀和报告基因检测相结合，以阐明甘蓝在淹水胁迫下所涉及的分子调控通路。

我们的目标是鉴定出淹水耐受性的关键调控因子，希望这将有助于培育出具有更强淹水耐受性的新型甘蓝品种。首先，用市售植物基质填满48孔穴盘的方形圆角孔穴，并将Fuyudori和228号甘蓝种子播种于培养基质中，深度约为1厘米。为配制12.5毫升酶解液，需将含有10毫摩尔MES和0.6摩尔甘露醇的溶液预热至55摄氏度。

然后加入1.5%纤维素酶R-10和0.75%离析酶R-10。搅拌溶液，并在55摄氏度继续温育10分钟。让酶溶液冷却至室温。

然后加入 10 毫摩尔氯化钙和 0.1% 牛血清白蛋白。使用 0.22 微米注射器滤器将酶溶液过滤灭菌至一个 9 厘米的培养皿中。在生长 2 至 3 周后，于第二片叶阶段采集白菜幼苗，用于叶肉原生质体的分离。

从5到8株甘蓝幼苗上采集第二对新展开的真叶。使用锋利的剃须刀片将叶片切成0.5至1.0毫米宽的条状。立即将叶条转移至 freshly prepared 酶解液中。

将白菜叶片条在黑暗条件下进行30分钟的真空渗透。真空渗透后，在黑暗条件下将叶片条浸入酶解液中4至16小时。次日，用等体积的W5溶液稀释含有原生质体的溶液，以终止酶解反应。

为释放原生质体悬液，轻轻在摇床上旋转混匀混合物。随后将细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤至50毫升锥形管中。在4摄氏度条件下，以150 ×g离心原生质体溶液2分钟。

沿管壁以大约每秒1毫升的流速加入10毫升W5溶液，以洗涤沉淀的原生质体。最后一次离心后，将原生质体重悬于W5溶液中，并将试管置于冰上30分钟。然后每次移除1毫升上清液，直至完全除去所有上清液。

将原生质体重悬于预冷的冰上MMG溶液中。使用血细胞计数板测定原生质体浓度。用MMG溶液将最终浓度调整至每毫升4 × 10⁵个原生质体。

在分离和过夜消化后，Fuyudori 的原生质体产量为 1.04 × 10⁷，228 品种的原生质体产量为每克鲜重 4.00 × 10⁶。如 GFP 报告基因所示，Fuyudori 和 228 两个品种的原生质体转染效率均高于 40%。分离白菜原生质体后，将 100 µL 浓度为 4 × 10⁴ 的原生质体与 10 µL 质粒混合，冰上放置 10 分钟。

向原生质体溶液中加入等体积新配制的PEG溶液，轻轻混匀。将原生质体混合液在室温避光条件下孵育10分钟。然后加入440 µL W5溶液以终止反应。

在4°C条件下，以150 G离心转染后的原生质体2分钟。用750微升富氧W5溶液重悬沉淀。将重悬的原生质体转移至预先用1%牛血清白蛋白包被的六孔组织培养板中。

对于耗氧袋诱导的缺氧处理，将含有W5原生质体溶液的培养皿置于3.5升厌氧罐中，然后在罐内加入两个除氧剂包以建立缺氧环境。处理结束后，在4°C条件下以150 ×g离心2分钟收集原生质体。

弃去上清液，将收集的原生质体在液氮中速冻，然后进行双荧光素酶检测。与对照相比，氧气吸收剂处理使 BoADH1 启动子活性提高了 7.0 倍，表现出最强的低氧响应。BoSUS1L 启动子活性增加了 5.6 倍以上，其中氧气吸收剂处理在所有处理中诱导效果最显著。