一种验证胼胝质介导的胞间连丝门控在向性反应中作用的策略

本实验的总体目标是筛选在向性反应过程中参与胼胝质介导的胞间连丝门控的基因。该方法有助于回答植物发育生物学领域中的关键问题，例如哪些未知基因在向性反应期间调控胞间连丝介导的细胞间信号传递。该技术的主要优势在于操作简便、有效且可重复。

初学者通常会遇到困难，因为在整个操作过程中无损伤地处理拟南芥黄化幼苗下胚轴具有挑战性。我们最初是在建立葡萄糖合成酶GSL8在胞间连丝门控中的作用规律时想到这一方法的。本方法的可视化演示至关重要，因为音频中提到的步骤并未解释那些因需要特殊装置和操作而难以实施的关键环节。

在实验前一天配制Murashige和Skoog（MS）培养基。经高压灭菌后，每块125毫米的方形培养皿中加入50毫升培养基。次日，将经1.1%次氯酸钠消毒的种子点种于半干的培养皿上。

用1毫米的微量移液器吸头，将200微升水滴加到种子上。将种子排列成5行，行间距为1.8厘米，每行内种子间距至少0.1厘米。在用外科胶带封盖培养皿前，让部分水分蒸发。

然后用铝箔纸包裹培养皿，并将其放入盒中。在 4 摄氏度条件下将盒子孵育三天。经过三天的低温处理后，将种子盒转移至 22 摄氏度环境中继续孵育三天。

再过三天后，在暗室中用绿光检查种子的萌发状态。通常，三天大的Col-0黄化幼苗长度可达1.6厘米。在绿光下分析其改变的向光性和向重力性反应。

使用无菌的接种针，挑选大小相近且下胚轴生长直立的幼苗。从下胚轴的最底端轻轻提起幼苗，避免触碰其他部位。然后，将选好的幼苗小心转移到新的MS琼脂平板上。

在新的培养皿上，以相同方向摆放幼苗的弯钩部分。每种遗传背景至少选取20株幼苗排成一行，并对每块培养皿设置重复。每块培养皿包含两种基因型，排成两行。

为了检测向光性反应，将培养皿置于一个黑色盒子中，使幼苗保持垂直方向，并将盒子的一侧留空，对准培养皿的边缘。然后将盒子放入植物生长培养箱中，用单向白光照射培养。

为检测向重力反应，用铝箔包裹培养皿并放入黑色盒子中，使幼苗保持水平状态。在多个时间点（通常从90分钟开始，持续至12小时）在弱光条件下对培养皿进行成像。使用扫描仪以600 DPI分辨率采集JPEG图像。

为测量幼苗的弯曲角度，请在 ImageJ 软件中加载幼苗图像。使用放大工具进行放大，滚动至待分析的幼游戏副本。然后使用角度工具测量幼苗弯曲的角度。

为此，请双击左键选中原始下胚轴生长方向的点A，并将鼠标拖动至弯曲起始点B。然后，单击左键绘制第一条直线。接着，将鼠标从点B拖动至弯曲终点C，再次单击左键绘制第二条直线，形成夹角A。真实的弯曲角度为角B，其数值等于180度减去角A。现在，通过按下键盘上的M键来测量并记录角A。结果文件将单独打开。

重复上一步骤，测量其余幼苗，并使用数据集电子表格文件测量两种不同背景下的平均角度。本实验所需的HPTS琼脂糖块的制备方法详见文字版实验方案。首先准备植物样品。

在此示例中，分析胞间连丝大小排阻极限发生改变的突变体。首先，为实验建立一个平台。将显微镜盖玻片放置在新的MS培养基平板上。

接下来，从培养有三天暗生长幼苗的 MS 平板中，使用锋利的手术剪小心地从弯钩基部剪下幼苗，并将其转移至盖玻片上。每种遗传背景至少转移五株幼苗。调整幼苗方向，使切除部位以下仅有 0.5 厘米的下胚轴保留在盖玻片上，其余部分的下胚轴接触培养基。

然后，将一块 HPTS 琼脂糖凝胶置于切除的幼苗上方，使切除部位与 HPTS 凝胶块接触，确保接触良好。让凝胶块在下胚轴上放置五分钟。

然后，将下胚轴转移至含有双蒸水的10毫米培养皿中，振荡洗涤15分钟。接着，将洗涤后的幼苗转移至载玻片上。将每个突变体与对照样本并排放置，以便进行直接比较。

用 100 至 150 微升的双蒸水覆盖下胚轴，并加盖盖玻片。随后，按照文本方案中所述，使用共聚焦显微镜分析玻片。本实验应使用新鲜配制、不超过两天且避光保存的染料。

为了抑制新生胼胝质的合成，向染料中加入1.5毫摩尔的2-脱氧-D-葡萄糖。开始该实验时，选取三日龄的黄化幼苗进行胼胝质染色，幼苗可具有或不具有向性反应。使用精细的外科剪刀从幼苗的弯钩部位将其剪下。

然后，用牙签尖将幼苗转移至含有2 mL染色缓冲液的小型培养皿中。将幼苗置于染色缓冲液中，在30 rpm持续振荡条件下避光孵育2小时。染色结束后，用双蒸水洗涤幼苗2分钟，以去除多余的染色缓冲液。

洗涤后，选择每种遗传背景至少五株幼苗进行共聚焦分析。使用 ImageJ 软件测量胼胝质信号强度。在成像软件中打开已以 JPEG 格式保存的共聚焦显微镜文件。

接下来，使用矩形选择工具，将光标拖动至图像上，选中待检测的区域。然后按下 M 键，测量并记录信号强度的数值。结果文件将单独打开。在结果文件中，“Mean”表示所选区域的信号强度，而非多个区域的平均值。

逐一以该方法分析每株幼苗的信号。重复上述步骤，测量其余幼苗的信号，并利用数据集电子表格文件计算两种不同背景下的平均角度。根据所述实验方案，对AtGSL8的地塞米松诱导型RNAi株系进行了分析。

DsGSL8 幼苗在向光性和向重力性方面表现出明显缺陷。它们在这两种力的作用下均未出现弯曲现象。胞间连丝运动的改变显示，与对照组相比，dsGSL8 RNAi 沉默植株中 HPTSA 染料的移动范围显著更广。

胼胝质是调控胞间连丝大小排阻限的关键因子之一，而AtGSL8是一种已知的胞间连丝胼胝质合成酶。因此，进行了胼胝质苯胺蓝染色实验。在对照组中，胼胝质在六小时后开始积累，以黄色箭头标示。

然而，六小时后，突变体的胞间连丝胼胝质水平持续偏低。在向光性反应发生仅三小时后，胼胝质合成的缺失已可明显测得。观看本视频后，您应能充分理解如何通过单纯调控胼胝质来快速筛选参与向性反应中调控胞间连丝门控的基因。

掌握该技术后，在拟南芥幼苗萌发三天后，大约六小时内即可完成实验。在进行该操作时，需注意转移幼苗过程中避免对其造成损伤。此外，在加样检测过程中，确保琼脂与下胚轴之间形成良好接触至关重要。

随着这一进展，该技术为发育生物学开辟了道路，使其能够探索在向性过程中调控共质体导通性的基因，包括新基因。