用于高倍率活细胞共聚焦荧光显微镜观察的双轴拉伸装置

我们研究细胞在生理和病理条件下对机械刺激的响应与适应机制。为此，我们使用拉伸装置对细胞施加外部力，此处为应变。

我们发现了细胞和细胞组织对特定机械刺激的反应方式，以及它们如何对其他生物信号产生机械响应。

与其他设备相比，我们的拉伸装置具有更高的多功能性，因为它不仅可以对培养在不同硬度的聚丙烯酰胺凝胶上的细胞进行拉伸，还可以进行压缩实验。

[旁白] 首先，将PMMA环放置在一张白色实验台纸上。使用刀片仔细沿PDMS包被的培养板边缘切割，确保整个圆周形成整齐的切口。用镊子轻轻提起膜的一侧边缘，然后用拇指缓慢剥离，使膜的一半均匀地从培养板上脱离。用手指将96%乙醇均匀涂抹在PMMA环的整个上表面。接着，从先前抬起的边缘处小心地将PDMS膜从培养板上取下，然后将其对称地放置在覆盖有乙醇的PMMA环上，注意避免产生褶皱，同时不要拉伸。随后，取另一个空的PMMA环，将其放置在固定环的上方。使用金属夹具将两者夹紧，使PDMS膜被夹在两个环之间。将拉伸环的下半部分放置在支撑架上。将夹有PDMS膜的环放置在拉伸环上，并用力向下压，直至完全就位，确保密封垫圈正确安装。将圆形黄铜配重块放置在样品上方。接下来，将金属拉伸环的上半部分放在顶部，对准螺钉孔。插入所有螺钉并拧紧。使用刀片轻轻沿环边缘切割PDMS。用培养皿覆盖整个装置，以保护膜免受灰尘污染。通过连续稀释法，制备一份PBS中0.2微米荧光微球的250,000倍稀释液。将10至30微升的微球溶液滴加在PDMS膜的中心位置。在不超过40摄氏度的温度下使其干燥，以避免后固化带来的干扰。现在，将拉伸装置安装到显微镜载物台支架上，并将拉伸柱固定在显微镜上。在拉伸柱的圆形区域充分涂抹润滑剂。将已准备好的拉伸环安装到拉伸柱上，并旋紧顶部盖帽以密封装置。然后，将真空控制箱后端连接至真空源，再将前端连接至拉伸柱。为进行应变校准，选择一个包含高密度微球及可识别微球团块的感兴趣区域。采集该视野在静止状态下的图像，并保存其位置。施加-20毫巴的低真空水平以产生应变，引起各个方向的位移。随后，在Z平面重新对焦，并在XY方向移动载物台以定位相同的感兴趣区域，采集拉伸状态下的图像。然后释放应变，并重复上述步骤，逐步提高真空水平。将采集的图像按样品分类存储在文件夹中。将无拉伸条件下采集的参考微球图像命名为reference_str1，将不同递增真空水平下拉伸的图像依次命名为stretched_str1、stretched_str2、stretched_str3等。为量化应变，打开MATLAB并加载凝胶应变分析代码。设置参数后，定义父目录及实验文件夹路径，运行代码。随后，按照代码提示依次打开stretched_str1和reference_str1。计算每个真空水平下的中位应变矩阵。在至少三个样品上重复此过程后，绘制中位应变矩阵与真空水平的关系图，获得校准曲线。为包被PDMS环，先在紫外线下灭菌15分钟。在生物安全柜内，用无菌PBS冲洗培养板。吸除用于冲洗的所有PBS后，在环的中心位置滴加100至200微升的包被溶液。从PDMS膜的底面用永久性记号笔标记液滴的轮廓，然后进行孵育。在实验当天，用PBS洗涤黏附蛋白。消化细胞后，进行细胞计数。将适量细胞以约20至50微升的标准细胞培养基接种，以促进细胞贴附，并置于具有湿度控制的二氧化碳培养箱中孵育。20至30分钟后，轻轻在细胞上方加入500微升培养基，将培养板放回培养箱，使细胞进一步铺展。对于单次拉伸-释放循环及成像操作，将拉伸环如前所述安装至显微镜载物台上。找到目标细胞后，记录其位置并采集拉伸前的细胞图像。根据校准曲线，施加对应所需基底应变的真空水平，以拉伸细胞。为定位拉伸状态下的细胞，首先在Z平面重新对焦，然后在XY方向移动载物台，使细胞位于视野中心。在所需时间段内记录图像。返回细胞原始位置，并启动显微镜的采集模式，确保在重新对焦后立即开始图像采集。释放拉伸后，手动快速在Z平面重新对焦。在所需时间内采集释放后细胞的图像，并在整个采集过程中手动调节焦点。对于后期处理，打开Fiji软件并加载在静止状态和应变过程中采集的图像。使用Fiji的模板匹配插件选择细胞的某一区域进行图像对齐。校准确保了施加应变的可重复性和精确控制，证实了真空与应变之间在高达20%范围内近乎线性的关系。径向位移分析表明PDMS膜上的应变具有各向同性和均匀性。活细胞拉伸过程中的荧光成像显示，拉伸释放后细胞膜出现内陷结构，这些结构在三到五分钟内重新吸收。对固定细胞进行再拉伸，可在拉伸状态下成像，避免了人为折叠伪影。带有图案化网格的PDMS膜支持多模态成像，可在荧光显微镜和扫描电子显微镜下定位同一细胞。在包被有纤连蛋白的柔软PAA凝胶上培养的细胞，仅在特定周期性拉伸条件下才会形成局灶性黏附结构，而未拉伸的细胞则不会形成。