使用 In-Cloning 工具包通过模块化克隆（MoClo）标准化组装多顺反子操纵子

我开发了能够从微小的单个分子元件开始，逐步组装出达到染色体规模的DNA构建体，并利用这些人造染色体对细胞进行重编程的方法。该领域的一项重要创新是模块化克隆工具包的建立，这类工具包能够从标准化分子元件库中实现多基因构建体的模块化组装。模块化克隆工具包通常被设计用于克隆单顺反子转录单元。

本方案展示了一种利用原位克隆工具包组装多顺反子转录单元的通用方法。这种克隆多顺反子转录单元的策略使得编码序列能够灵活地用于单独的转录单元或多个顺反子排列中。首先，选择要组装成转录单元的0级元件。

这些元件必须至少包含一个核糖体结合位点（RBS）、一个编码序列和一个终止子。选择转录单元在操纵子中的组装位置。根据所选位置，选择相应的受体质粒，并在SnapGene中模拟Golden Gate连接反应。

在Golden Gate反应中，使用SAP1酶从各自的质粒上释放核糖体结合位点、编码序列和终止子，并将受体质粒切开。将核糖体结合位点、编码序列和终止子组装到被切割的受体质粒中。接下来进行Golden Gate反应时，使用移液器加入每种所需插入片段各50飞摩尔以及50飞摩尔的受体质粒。

向反应管中各加入1微升10x T4 DNA连接酶缓冲液、T4连接酶和SAP1。然后加入无核酸酶水，使最终体积达到10微升。将反应管放入热循环仪中。

在37摄氏度下运行25个循环，每个循环3分钟；16摄氏度下4分钟；50摄氏度下20分钟。然后在80摄氏度下加热20分钟以灭活酶。可选步骤：向GG反应中加入0.5 µL SAP1，于37摄氏度孵育1小时。

将5 µL反应混合物移液至50 µL化学感受态E.coli细胞中。将离心管浸入42 °C水浴中30秒，进行热激转化，然后将离心管置于冰上2分钟。接着，将细胞在1 mL培养基中孵育1小时，以促进恢复。

将100微升转化后培养物涂布于含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂平板上。在37摄氏度下倒置培养过夜。次日，使用接种环或移液器吸头挑取两个白色菌落。

将每种接种物接种至5 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中。在37°C、250 rpm条件下于摇床中过夜培养。按照生产商说明书进行质粒提取。

加入1微升10x消化缓冲液和1微升BBS1，对1微克提取的血浆DNA进行消化。用无核酸酶水补至总体积为10微升，并进行孵育。随后将消化后的质粒加样到1%琼脂糖凝胶上，在100伏电压下电泳运行35分钟。

然后对凝胶成像，确认质粒的正确组装。要组装一个 Level M 载体，需选择待组装的 Level 1 转录单元。通过使用酶 BBS1 释放第一个和第二个转录单元以及末端连接子，模拟 Golden Gate 组装过程。

同时将受体质粒切开，然后将三个部分组装到受体质粒中，形成多顺反子转录单元。在一级质粒组装的阴性对照中（缺少终止子片段），未产生任何菌落，而完整反应组产生了292个白色菌落，无红色菌落。在37摄氏度下进行多基因构建体的组装时，若缺少第二个表达盒，则仅产生两个白色菌落，而完整组装组则产生9个大菌落和435个小菌落。

在 30 摄氏度条件下，多基因组装的阴性对照产生了 4 个白色菌落，而完整反应组产生了超过 1,500 个菌落。对受体质粒 PMA60 进行 BSA1 酶切，得到预期的单一条带，大小为 5,500 个碱基对。对 24 个菌落的质粒进行 BSA1 酶切分析，结果显示 24 个中有 23 个显示出正确的酶切图谱，即在约 4,300 碱基对和 1,700 碱基对处出现两条带。

荧光成像显示，在含有OC6诱导剂的平板上，菌落表现出强烈的绿色和青色荧光，而在无诱导剂的平板上，菌落的荧光极弱或无荧光。