基于CRISPR的穿梭克隆：一种高通量克隆方法
2025年6月13日
我们介绍一种高通量克隆方法——基于CRISPR的穿梭克隆（CRISPRshuttle cloning）的实验方案，该方法能够在无需对目标DNA片段进行PCR扩增的情况下，实现DNA片段在不同载体之间的转移。
我们描述了高通量克隆方法CRISPRshuttle的方案。这涉及在载体之间转移目标 DNA 片段，而无需对 DNA 片段进行 PCR 扩增。现有技术，如门户输注和单载体克隆 PCR 扩增。这种方法需要特定片段的程序，包括初级设计和分泌验证。这些标签是劳动密集型且耗时的。CRISPR 穿梭消除了 PCR，同时将载体之间的目标 DNA 片段转移到连续的试管反应中。该方法超越了对特定片段处理的需求，从而加快了样品的构建。
[旁白]首先，通过组合屏幕上显示的试剂，为给定数量的消化反应制备预混液。将正确标记的 0.2 毫升管放在冰上的铝制冷却块中。通过混合适量的 CAS9、sgRNA、10、CAS9 缓冲液和 DEPC 处理水，制备用于 N 次反应的预混液。将预混液彻底混合并旋转。将 3.75 微升预混液等分到每个反应管中。将 0.75 微升 0.03 微摩尔 PLX 304 ORF 质粒加入每个彻底混合的试管中，并将试管在 37 摄氏度下孵育一小时。通过混合 0.14 微升 3.36 微摩尔线性化 pBIDC-UASC-pLXvect 和 1.8 微升 Gibson 组装预混液来制备预混液。将预混液彻底混合并旋转。现在将 1.94 微升预混液等分到每个试管中。将 1.66 微升 CAS9 切割质粒加入每个试管中。充分混合并在 50 摄氏度下孵育一小时。在冰上解冻细菌感受态细胞。将 10 微升解冻的细胞等分到每个预冷的 1.5 毫升管中。轻轻地将 10 微升感受态细胞与 1 微升 Gibson 组装产物混合。将试管放在冰上 30 分钟。在 42 摄氏度下对试管进行热电击一分钟，然后在冰上冷却两分钟。将 100 微升预热的 SOC 培养基加入每个试管中，并在 37 摄氏度下以 250 RPM 摇动一小时。最后，将细胞置于含有每毫升氯霉素15微克的LB琼脂平板上，并在37摄氏度下孵育过夜。该图显示了使用 CRISPRshuttle 系统生成的 UAS-cDNA/ORF 质粒限制性分析的代表性结果。在该分析中，对 15 个 UAS-cDNA/ORF 构建体的 PVU2 限制性酶切表明，所有样品在大约 1072 个碱基对和 1,820 个碱基对处表现出预期的片段模式。
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概述
本文介绍了一种基于CRISPR的穿梭克隆（CRISPRshuttle cloning）高通量克隆方法的实验方案。该创新技术能够在无需PCR扩增的情况下，实现DNA片段在不同载体之间的转移。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因工程
- 分子生物学
- CRISPR 技术
背景
- 传统的克隆方法通常需要进行 PCR 扩增。
- CRISPR 技术彻底改变了基因操作方式。
- 高通量方法对于大规模研究至关重要。
- 高效的载体转移对于多种应用十分关键。
研究目的
- 介绍一种新型克隆方法。
- 简化DNA片段转移的流程。
- 消除克隆过程中对PCR的需求。
使用的方法
- CRISPRshuttle 克隆方案的开发。
- DNA 转移效率的评估。
- 与传统克隆方法的比较。
- 该方法在多种载体系统中的应用。
主要结果
- 在载体之间成功转移DNA片段。
- 与PCR方法相比，显著节省时间和资源。
- 在多次测试中均表现出高效率。
- 在基因研究中具有广泛的应用潜力。
结论
- CRISPRshuttle 克隆是传统方法的一种可行替代方案。
- 该方法可提高基因工程的效率。
- 未来的研究可利用该技术实现复杂的基因操作。
常见问题
行业应用价值
高通量生成全基因组范围的质粒文库是系统性基因功能研究和生物制药研发中靶点验证的关键推动因素。基于CRISPR的穿梭克隆技术（CRISPRshuttle）无需PCR扩增，简化了DNA片段在不同载体间的转移过程，显著加快了文库构建速度。该技术能力在关键发现阶段提升了预测的可靠性与操作效率。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可实现基因组规模质粒文库的快速构建，用于功能基因组学筛选。
- 支持对多种生物通路中的基因功能进行系统性研究。
- 通过实现高通量载体构建，促进生物学风险评估和可靠的靶点验证。
- 提高下游靶点选择与筛选的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 制备经过验证的质粒构建体，用于可扩展的筛选工作流程，避免PCR引入的序列偏差。
- 标准化克隆产物，支持实验的可重复性及定量检测方法的开发。
- 加快高通量化合物评价和表型筛选平台的准备工作。
- 支持在多种检测体系中高效重复利用供体质粒资源。
转化与临床前研究
- 简化与疾病相关的基因构建体的生成，用于临床前模型开发。
- 通过实现基因构建体的快速迭代，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 减少转化生物标志物和机制研究中的技术瓶颈。
- 提供可靠的基因工具，增强基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
CRISPRshuttle 克隆技术整合了早期发现与先导识别的环节，能够实现从假设驱动的基因筛选到高通量构建体生成与筛选的无缝衔接。
- 发现生物学：通过实现基因靶标的快速、可扩展克隆，加速假设验证和通路绘制。
- 筛选：提供标准化、无需PCR的载体构建子，支持可重复的检测开发与筛选项目。
- 分析：提供关于克隆效率和构建子完整性的定量输出，支持基于数据的决策。
- 转化研究：促进用于疾病相关模型和生物标志物研究的载体构建。
- 企业级复用：建立可重复使用、高通量的克隆平台，满足持续的项目组合需求。
运营与企业影响
- 科学价值：提高基因功能研究中预测的可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：实现高效率（>94%）和可扩展性，使小型团队能够快速构建文库。
- 战略价值：通过加快载体构建的可获得性，提升决策质量与资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的已验证靶点和检测方法的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备CRISPR/Cas9介导的切割和Gibson组装技术的专业知识。
- 需要获得兼容的供体质粒和适用于CRISPR穿梭的载体。
- 要求采用标准化操作流程，以确保不同团队间的可重复性和数据完整性。
- 针对不同的载体骨架或物种特异性系统，可能需要进行适应性调整。
- 实验效率和通量依赖于试剂质量和工作流程的优化。
