扩展显微技术：利用常规显微镜实现高分辨率荧光成像

我们是研究微管及其在不同模式生物中相关功能的细胞生物学家。我们的研究目标是探讨微管在细胞组织、形态发生、纤毛形成以及细胞分裂中的作用。在过去五年中，我们通过使用扩张显微镜技术，推动了对环状分子结构组成的理解。

通过这种方法，我们揭示了它们组装和功能的关键特征。通过将扩增显微技术与冷冻固定相结合，本方案能够在保持细胞组分接近天然结构的同时实现高分辨率成像，从而克服了超分辨率显微镜的主要局限性。因此，扩增显微技术是一种低成本且易于实施的技术，可使所有实验室都能获得超分辨率成像能力。

首先，在通风橱中使用注射器和针头将每个五毫升离心管加入一毫升超干燥丙酮。将离心管垂直放入金属架中，并置于液氮中进行冷冻。取一个30厘米×30厘米的厚壁聚苯乙烯盒，装入半盒干冰，然后向Vitrobot型杜瓦瓶中注入液氮，直至不再有蒸发为止。

现在，将蜘蛛从浸入装置中取出，并用液态乙烷填充金属浸入室。等待10分钟，使乙烷达到平衡状态。然后，用细镊子夹取一片12毫米的盖玻片，轻轻在纸巾上蘸一下，吸去盖玻片上多余的培养基。

使用装有与冷冻载样器兼容的夹紧环的镊子夹住盖玻片的一半位置。将夹持盖玻片的镊子放入冷冻载样器的支架中，并用Whatman滤纸吸去残留的任何培养基。启动冷冻载样器，将盖玻片迅速浸入金属腔室中的乙烷溶液内。

然后，迅速将盖玻片转移至含有冷冻丙酮的离心管中。将装有盖玻片的离心管以大约45度的角度置于干冰中孵育。将密闭容器置于转速设定为50至100 RPM的旋转摇床上，在4°C下振荡过夜，使温度逐渐上升。

接下来，从盒子中取出大部分干冰。继续在轨道摇床中振荡额外的45分钟，使温度从-80摄氏度升至-20摄氏度。短暂打开并关闭每个离心管，以释放内部压力。

然后，将每张盖玻片转移至已预先加入预冷的100%乙醇溶液的12孔板或合适的容器中。经过5分钟孵育后，通过梯度乙醇溶液对盖玻片进行再水化。将盖玻片转移至PBS后，置于显微镜下观察。

使用精细镊子轻轻刮擦表面，并将所有盖玻片调整至正确的一面朝上。将盖玻片放入含0.5至1毫升PBS中2%丙烯酰胺和1.4%甲醛溶液的四孔板中。然后在37°C条件下，不加振荡孵育盖玻片。

接下来，在凝胶形成前，将10%过硫酸铵（APS）和凝胶溶液置于冰上解冻10分钟。使用一层湿润的纸巾和Parafilm制备一个湿室。然后将其置于4摄氏度保存。

10分钟后，将湿盒置于冷块上，用于凝胶过程。随后，从蛋白锚定溶液中取出盖玻片，用纸巾连续两次轻轻吸去多余液体。向凝胶溶液中加入APS，使其终浓度达到0.5%，涡旋混匀2至3秒。

然后，用移液器将两滴35微升的液体滴加到湿润室内的Parafilm上，轻轻将每个盖玻片覆盖在液滴上，使细胞朝下浸入凝胶溶液中。将湿润室转移至37摄氏度的培养箱中孵育30至60分钟。进行变性时，使用直径为0.4厘米的活检打孔工具取出凝胶小块，并将其放入含有1毫升变性缓冲液的六孔板中。

振荡培养板10至15分钟，直至凝胶从盖玻片上脱落，将脱落的凝胶碎片转移至装有新鲜变性缓冲液的1.5毫升微量离心管中。在95摄氏度下孵育凝胶90分钟。孵育结束后，将凝胶转入双蒸水中洗涤10分钟。

使用毫米纸测量凝胶的直径，以评估凝胶膨胀因子。用约200微升多聚赖氨酸溶液包被干净的盖玻片。室温孵育盖玻片1小时，然后用双蒸水洗涤三次，以去除多余的多聚赖氨酸。

盖玻片干燥后，置于 4 摄氏度保存，以备后续使用。将凝胶正确朝向放置，细胞面朝上，置于无绒纸上，使其干燥以去除多余水分。最后，将干燥的凝胶细胞面朝下，固定于聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上。

与PFA固定相比，冷冻固定能更有效地保存RPE1细胞中的线粒体网络，这一点通过NHS酯和ATP5A染色得以证实，并且能够分辨出线粒体的嵴结构，而这些在PFA固定样品中不可见。在RPE1细胞有丝分裂过程中，与PFA固定相比，冷冻固定对动态微管（包括胞质和星体微管）的保存效果更佳。在布氏锥虫（Trypanosoma brucei）中，通过TDH和NHS酯染色观察发现，与PFA固定相比，冷冻固定更好地保留了线粒体的结构以及整体细胞结构。

此外，根据BIP染色结果，冷冻固定对内质网的保存效果优于PFA固定。在冷冻固定的RPE1细胞中观察到裂纹，但这些裂纹并未破坏细胞器（如线粒体或微管）的超微结构。气泡样结构和波浪状微管的出现，伴随膜性细胞器完整性的丧失，提示冷冻固定效果不佳。

扩增质量取决于丙烯酸钠溶液的澄清度，可用的溶液呈无色或微黄色且半透明，而不可用的溶液则呈浑浊的橙色。