基于微型生物反应器的锚定依赖型间充质基质细胞制备及其在急性呼吸窘迫综合征中的应用

我们研究细胞如何与其环境相互作用，包括在将细胞作为治疗手段进行生产或制造时的情况。在此，我们探讨了如何克服某些临床转化障碍，以实现对间充质基质细胞（MSCs）等贴壁依赖性细胞的生产。人们日益认识到，细胞群体的变异性会影响每一批次或每位个体最终细胞产品的稳定性和效力。

这些挑战甚至可能影响某些细胞疗法的监管审批。我们致力于解决这一难题，旨在实现每毫升液体中获得高密度细胞，同时对环境进行高度控制，并具备可放大性。本方案提供了一种方法，可用于对间充质干细胞（MSCs）等贴壁依赖性细胞进行在线环境监测。

这种过程控制相较于目前大多数实验室和临床生产中仍在使用的烧瓶具有优势。对于间充质干细胞（MSCs）及其他对机械信号敏感的细胞类型，仍存在若干尚未解决的问题。例如，此类方法如何帮助工程化细胞以应对其他疾病状态？

首先，取下瓶架中与 LL 瓶相连的透明塑料盖。使用一支新的无活塞无菌 50 毫升注射器，将喷嘴连接至 LL 瓶。将无菌过滤水倒入注射器筒内，然后注入 LL 瓶中。同样地，向 L 瓶中加入 25 毫升不含 FBS 的低糖 DMEM，向 R 瓶中加入 25 毫升无菌 PBS，向 RR 瓶中加入 8 毫升抗黏附冲洗液。重复此操作，以制备实验所需数量的耗材。

接下来，对实验中将使用的每个模块进行自检。当模块成功通过自检中的所有检测后，取出自检盒并将其放入避光保护袋中储存。将耗材安装到生物反应器上。

取下耗材阀门上的绿色胶带，将耗材安装到样本舱中。重新安装夹具，并检查是否有漏气声以确认密封牢固。将白色压力传感器管路、红色气压管路和蓝色真空管路连接在耗材与基站或样本舱之间。

在开始新实验之前，使用白色泪滴形夹子夹紧侧向进样口。在软件界面中点击“冲洗瓶”图标。启用 L 瓶对应的单选按钮，选择“排液至废液”，然后点击“开始冲洗 MSCserum”。

在“瓶内物质”窗口中，指明 MSCserum 位于含有 PBS 的 R 瓶中。然后进入“手动操作”界面，对废液瓶执行三次“弹出清洗”循环。在“瓶内物质”窗口中，指明 MSCserum 现在位于含有抗黏附冲洗液的 RR 瓶中。

返回手动操作界面，对废液瓶执行一次排空清洗循环。30分钟后，用PBS冲洗耗材。排空反应器，等待细胞和微载体的注入。

在手动操作面板中，点击“重新接种”。将系统暂停在仪表盘提示接种反应器的步骤。随后，将重悬细胞的计算体积用移液器加入每个条件对应的含有微载体的15毫升锥形管中。

用新鲜的温热人源间充质干细胞培养基将每根试管补液至 2.2 至 2.5 毫升。每次操作一种或两种耗材，将其从底座上取下并移入生物安全柜中。使用绿色四英寸钝针，将细胞与微载体混合物吸入一支 5 毫升注射器中。

将混合物注入反应器中。小心握住卡带底部附近的注射端口管路，注意不要将管路拔下。使用拇指和食指之间的滚动动作，将注射端口管路扭转两整圈，以在管路中形成打结状的扭结。

将结扎结塞入进样口底部附近的切口处，并用一小块实验室胶带固定。然后将耗材放回基站。对所有耗材重复进样操作后，通过软件界面提示接种已完成。

当软件返回主页后，从耗材输出管路中取下白色夹子。进入手动操作界面，将输出端口设置为 P（灌注），执行排出多余液体功能。启用静态混合模式，设置循环为开启 680 秒、关闭 120 秒，混合频率设为 5 赫兹。

开始收集细胞时，使用1毫升注射器吸取200微升Pronase以及大约300至400微升空气。拧开侧端口输液管上的帽盖，用70%乙醇喷洒无针阀连接器。撕下结扎的侧端口输液管上的胶带，解开结，并打开白色泪滴状夹子。

现在，连接1毫升注射器，缓慢将蛋白酶注入反应器中。随后注入空气，以确保液体完全注入。重新夹紧梨形夹，并盖上进样管的盖子。

然后将耗材放回舱内，重新连接所有管路，移除白色C形夹，并恢复混合。将废液瓶和培养基源瓶置于冰上。启动5分钟计时器，使Pronase在反应器中消化微载体。

五分钟后，通过检查反应器中微载体是否消失来确认其已降解。进入手动操作模式进行细胞收获，设置循环次数为三次，选择废液输出端口 W，然后点击“排出清洗”。排出清洗循环完成后，将耗材转移至生物安全柜中。

然后使用10或20毫升注射器抽出废液瓶中的内容物。将废液瓶中的内容物转移至15毫升锥形离心管中。在300×g条件下离心5分钟。

吸弃上清液，并评估细胞沉淀的大小。在微型生物反应器系统中，环境条件（包括pH、温度、溶解氧和二氧化碳）在整个10天的培养期间均稳定维持。与组织培养用聚苯乙烯培养瓶条件相比，微型生物反应器中的pH波动显著更低。

微型生物反应器中的细胞得率高于T25培养瓶，同时保持相似的细胞活力。在测定的14项与效力相关的质量属性中，有9项在微型生物反应器条件下的mRNA表达水平显著高于T75培养瓶。