基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术

我们致力于开发高性能的循环肿瘤细胞（CTC）分离与分析方法，通过液体活检推动精准肿瘤学的发展。目前市面上的CTC分离平台通量低、效率差，且与下游分析平台不兼容，限制了生物学信息的获取。

本研究采用微流控CTC分离平台，显著提高了检测率。我们还应用了稀有细胞单细胞测序芯片，以进行更深入的液体活检分析。首先，将25 µL洗涤后重悬的链霉亲和素修饰磁珠加入含有1 µg生物素化EpCAM抗体的离心管中。

将混合物在室温下孵育，同时以每分钟20转的速度旋转40分钟，以制备免疫磁珠。使用磁力架将磁珠与上清液分离。去除上清液后，将磁珠重悬于25 µL分离缓冲液中。

在一到两秒内用移液器吸取20微升磁珠悬浮液，确保不引入气泡。立即将芯片垂直放置在磁铁上，静置五分钟使磁珠沉降，期间避免扰动。用注射器收集四毫升血液样本，确保排除气泡。

用液体密封芯片的进样口和出样口以去除气泡，然后将样品进样管和出样管插入芯片。使用注射泵以每小时1.5毫升的流速注入样品。加载样品后，以每小时0.2毫升的流速向HB芯片注入60微升DPBS，以洗去未结合的细胞。

移除磁铁，并手动注入1.5毫升5% BSA以洗涤芯片并释放捕获的肿瘤细胞。在乙醇中配制10% MPTS溶液。立即将20微升该溶液注入HB芯片中，并在室温下孵育一小时。

用无水乙醇冲洗HB芯片一次，然后在100摄氏度下干燥一小时。接着，用乙醇配制浓度为0.5毫克/毫升的GMBS溶液。将芯片冷却至37摄氏度后，加入GMBS溶液并进行孵育。

用双蒸水冲洗HB芯片两次，随后用DPBS冲洗两次。立即向HB芯片中加入15微克/毫升的链霉亲和素，室温孵育一小时，或在4摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，用DPBS缓冲液冲洗HB芯片两次。

通过向 DPBS 中加入 0.2% BSA 和 20 微克/毫升生物素标记的 CD45 抗体，配制 CD45 抗体缓冲液，并调整至最终体积。取 20 微升 CD45 抗体缓冲液注入 HB 芯片，用于白细胞的阴性筛选。室温孵育 1 小时后，用 DPBS 冲洗芯片。

向HB芯片中加入含有3% BSA和0.05% Tween 20的封闭液。将制备好的样品吸入注射器中，确保无气泡存在。然后用液体密封芯片的进样口和出样口，并将进样管和出样管连接至芯片。

使用注射泵以每小时0.6毫升的流速注入样品。从芯片出口收集纯化的肿瘤细胞，用于计数和单细胞测序。将200微升用DPBS配制的0.5% F-68溶液移入芯片入口。

手持芯片进行水浴超声。当微孔区域可见气泡时，继续超声30秒，以去除双孔中的气泡。随后，将200 µL肿瘤细胞悬液注入含有60,000个双孔的芯片中。

轻轻吹打芯片中的细胞悬液，上下吹打两次。然后再次置于脱色摇床中，振荡五分钟，以重悬未被捕获的细胞，并使其再次沉降。现在通过入口加入200微升DPBS和0.5% F-68溶液，并从出口吸出。

重悬条形码磁珠悬液后，立即向芯片入口注入 200 微升悬液，并以每分钟 10 转的速度振荡 20 秒。将磁珠悬液轻轻吹打混匀两次，然后放回振荡器。接着从出口端吸出条形码磁珠悬液，再用移液器加入 200 微升 20 倍浓度的 Tris-EDTA 和 50 毫摩尔二硫苏糖醇溶液。

从出口处吸出液体。进行细胞裂解和mRNA捕获时，缓慢加入200 µL细胞裂解缓冲液至芯片入口。立即加入200 µL矿物油以密封双孔。

将芯片出口流出的溶液移除至废液储液池中。然后将芯片水平放置，在室温下静置五分钟。缓慢向入口加入200微升6X盐溶液柠檬酸钠溶液。

移除废液，并从芯片出口抽吸残留溶液。缓慢加入 200 µL 的 6X 柠檬酸钠盐水溶液以充满芯片。将磁铁靠近芯片表面，并缓慢从入口向出口移动，以聚集带有条形码的微珠。

迅速将溶液和磁珠吸入含有6X SSC的离心管中。用200微升6X SSC洗涤条形码磁珠三次，随后用逆转录缓冲液洗涤一次。在磁场作用下观察到免疫磁珠分布均匀，而磁力去除后残留磁珠极少，表明释放成功。

CTC 分离芯片能够高效地从 1 毫升和 10 毫升样本中捕获肿瘤细胞。加入纯化芯片后，肿瘤细胞纯度进一步提高。在掺入极少量 LNCaP 细胞的外周血样本中，CTC 分选系统仍保持较高的捕获效率和纯度。

单细胞条形码芯片实现了85.6%的细胞 occupancy 比率和95.7%的条形码微珠 occupancy 比率，配对率达到81.9%。增加加载细胞数量可提高微孔的 occupancy 比率，同时不降低捕获效率。整合的循环肿瘤细胞（CTC）分离与单细胞测序工作流程获得了高纯度的肿瘤细胞，并准确保留了原始肿瘤细胞的比例。tSNE 分析将 PC3、LNCaP 和 Jurkat 细胞清晰地分为三个簇，每个簇均具有独特的标志物表达特征。

Jurkat细胞簇通过TRBC1、IGLL1、CD1E和CD3D的强表达来鉴定，并经T细胞活化通路富集分析确认。PC3和LNCaP细胞簇通过差异表达基因进行区分，其中PC3表现出高水平的微精蛋白表达，而LNCaP表达NEDD4。