一种用于Leptospira生物膜定量、结构与功能分析的模块化工作流程

我们将生物膜视为能够促进环境和宿主中持久存在的保护性结构，研究其形成动态、分子组成、适应性特征及其在感染中的作用。在实验室中结合结晶紫生物膜检测、时间序列成像、共聚焦显微镜、扫描电子显微镜和转录组学技术，通过整合性的多维度分析推动生物膜研究。首先，在平底螺旋盖玻璃试管中，使用EMJH培养基培养钩端螺旋体细胞。

在30摄氏度下有氧条件下静置培养菌液，直至其达到对数生长中期。确保菌液在405纳米处的光密度值介于0.2至0.4之间，相当于每毫升含有2×10⁸至5×10⁸个细胞。在20倍放大倍率下使用暗视野显微镜观察，确认细胞呈典型形态且无成团现象。

将处于对数中期且无节律性生长的已验证培养物用新鲜EMJH培养基按1:100的比例稀释，使浓度约为每毫升1×10⁶个细胞，并通过轻轻颠倒混匀，切勿涡旋振荡。接着使用无菌镊子将一张0.1微米的无菌亲水性聚碳酸酯膜平整地放置于无菌24孔板（带盖）每个孔的底部。向每孔加入1毫升无菌EMJH培养基，在30°C条件下预浸泡膜2小时。

接下来，从每个孔中移除浸泡液，注意不要移动膜的位置，然后加入1.5毫升稀释的细菌悬液，确保膜牢固地保持在孔底。随后，将一个盛有水的托盘放入培养箱内以维持湿度。将培养板置于30°C条件下静置培养，以促进生物膜的形成。

对于生长缓慢的菌株，可将培养板放置长达三周。在所需时间点，小心吸出尽可能多的培养基，注意不要扰动生物膜。用一毫升无菌 PBS 轻柔地冲洗每个孔，同时保持膜紧贴底部。

向每个孔中加入 1 毫升含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，在 37 摄氏度孵育 30 分钟，以固定生物膜样本。孵育结束后，移除固定液，并用 1 毫升 PBS 轻柔冲洗两次。向每个孔中加入 1 毫升 0.1%（质量体积比）结晶紫溶液，在室温孵育 15 分钟，确保盖玻片完全浸没。

然后弃去每孔中的结晶紫染液，并用一毫升 PBS 洗涤两次。倾斜培养板，沥干所有残留液体。将培养板置于室温下自然晾干，直至底物完全干燥，最好过夜晾干。

接下来，向每个孔中加入500 µL洗脱缓冲液，该缓冲液由体积比50%乙醇和50%冰醋酸组成。反复吹打混匀，以充分溶解生物膜中结合的染料。然后，将每个样品中的200 µL转移至光学透明的96孔微孔板中。

在570纳米处测定吸光度，并从经过所有步骤处理的未接种对照组中减去背景值。记录至少三次技术重复的平均值和标准差。按照之前所示方法获取培养板中的生物膜。

向孔中加入含有4%多聚甲醛和1%戊二醛的0.2摩尔磷酸钠缓冲液（pH 7.4）。将固定后的样品在37摄氏度下孵育30分钟。去除固定液，并用PBS冲洗样品两次，以保留表面附着的生物膜，同时尽量减少脱落。

现在将盖玻片浸入用 PBS 稀释的 1% 四氧化锇溶液中，孵育一小时，以增强扫描电子显微镜的对比度。随后用 PBS 冲洗基底两次。依次将样品浸入梯度乙醇系列中，每个浓度浸泡 10 分钟，进行脱水处理。

接下来，加入 500 µL 六甲基二硅氮烷，孵育 5 分钟。然后更换为新鲜的六甲基二硅氮烷，再孵育额外 5 分钟。之后，去除多余的溶液，将样品置于通风橱中完全自然晾干。

现在使用双面导电碳胶带将干燥的样品固定到扫描电子显微镜样品台（stub）上。对样品进行溅射镀膜，覆盖一层约10纳米厚的金或铂，以增强成像时的电子反差。最后，将制备好的样品台装入扫描电子显微镜中，并使用合适的样品 holder 进行固定。

如果可能，将样品室抽真空过夜，以提高成像质量。然后使用合适的放大倍数，在5至15千伏条件下采集二次电子图像，以观察生物膜的超微结构。经过21天培养后，结晶紫染色在钩端螺旋体（leptospira interrogans）和双曲钩端螺旋体（leptospira biflexa）的聚碳酸酯滤膜和玻璃盖玻片上均显示出可见的生物膜形态。

每种物种均表现出独特的结构特征，如点状、分支状或网状形态。在所有时间点，弯曲钩端螺旋体生物膜在570纳米处的吸光度值均高于问号钩端螺旋体，表明前者结晶紫滞留量更高，生物量积累更多。扫描电子显微镜观察问号钩端螺旋体生物膜显示：3天龄生物膜中已出现早期胞外基质沉积；14天时形成具有三维结构的成熟且具通道的基底层；至21天时，基质完全整合，结构致密，发育成熟。

我们优化的实验方案通过同步来自相同培养物的互补性读数，提高了结果的稳健性，降低了变异性，并揭示了单一方法难以获取的动态与结构信息。通过整合互补性分析，我们的研究实现了生物膜评估的标准化，阐明了钩端螺旋体的动态行为与结构特征，将结构特征与毒力关联起来，并增强了可重复的比较性研究。

未来的研究将通过构建突变体来关联调控机制与生物膜的形态及动态变化，阐明生物膜在环境中的持久性，并评估破坏生物膜信息传递或促进其分散的策略。