使用单抗体标记法对膜蛋白进行单分子定位显微成像

我的研究聚焦于T细胞的膜结构，旨在揭示与治疗靶向相关的新的纳米尺度机制。现有的成像方法通常无法直接观察细胞内纳米尺度的抗体-表位相互作用。本方案通过在细胞环境中实现直接观测，克服了这一局限性。

将样品安装到显微镜上并在表面沉积金胶体后，使用明场照明确认在目标区域内已沉积足够数量的胶体。在继续操作前，需确认目标区域内存在每区域5至10个金胶体的理想密度。对于抗体探针荧光染料的光学配置，请打开成像软件并进入光学配置设置。

选择合适的二向色镜，并设置激光激发波长和功率密度。调整相机的积分时间，并选择发射滤光片。然后，设置相机的像素合并，以获得150至160纳米的像素尺寸。

现在，通过在成像软件中选择光漂白模式，为光漂白步骤创建光学配置。将激光功率设置为100%，并将相机积分时间调整为1秒。在图像采集软件中设置成像参数，定义非照射间隔、帧数以及光漂白步骤的频率。

接下来，将CD81抗体用200微升含5% BSA的DPBS稀释至浓度为每毫升1微克，以制备成成像缓冲液。Jurkat T细胞的推荐终浓度为0.5纳摩尔，U-2 OS细胞为2纳摩尔。将制备好的成像缓冲液加入含有细胞的孔中，并在软件中启动图像采集以开始数据收集。

使用成像软件中针对膜单抗体标记配置的实时成像功能，以实时监测抗体结合过程。在图像采集软件中设置成像参数，至少采集10帧图像，并将非照明间隔设为5秒。启动采集后，评估所记录视频中单分子定位的稀疏程度。

如果在加入成像缓冲液后立即观察到多个重叠的抗体结合事件，或随时间推移单分子定位信号持续累积，则中止数据采集。将抗体浓度降低一倍，并在新的样品上重复采集。继续将抗体浓度逐次降低一倍，并重新评估单位面积内的事件数量，直至达到理想的单分子定位密度。

如果事件密度较稀疏，可将成像缓冲液中的抗体浓度提高一倍。在新样本上重复采集，并持续将抗体浓度逐次提高一倍，同时重新评估单位面积上的结合事件数量，直至达到理想的单分子定位密度。对于非激发间隔的优化，在图像采集软件中设置成像参数，以获取包含50帧的采集数据。

加入抗体并开始采集后，评估所记录视频中单分子定位的密度与稀疏程度。确定能够产生最佳单分子事件密度的最短非照射间隔时间。最后，如果随着图像采集的进行出现空间上重叠的结合事件，应定期引入光漂白步骤。

调整光漂白频率，以便在重叠事件累积之前去除结合抗体的荧光信号。在 MATLAB 软件中将文件路径设置为包含重建 M 细胞逗号分隔值文件的文件夹。点击 MATLAB 工具栏中的“运行”按钮执行代码。

当系统提示时，选择 M 细胞的 CSV 文件，然后单击“打开”以将其加载到程序中。使用先前定义的输入作为起点运行分析。评估包含未聚类定位数据的散点图。

选择一个最小点值，该值应高于噪声定位数量，但低于细胞上的定位数量。评估显示聚类数据的窗口，确认具有预期表型的细胞上保留了聚类，而细胞外的定位被最小化。

如果聚类参数过于严格，请降低最小点数阈值并增大 epsilon 值。如果聚类参数过于宽松，请提高最小点数阈值并减小 epsilon 值。最后，在调整完最小点数阈值和 epsilon 值后，重新运行代码以获得最优聚类结果。

将Jurkat T细胞以足够的间距固定，以保持膜的完整性，并允许抗体结合到膜上的表位。金胶体被用于可视化，并在M细胞成像过程中作为基准标记，以校正横向漂移。通过对非照射间隔的优化发现，在1纳摩尔抗体浓度下，五秒间隔产生的抗体结合事件空间重叠最少，优于更短或更长的间隔。

与未校正的重建结果相比，应用漂移校正改善了M细胞图像的重建效果。基于密度的M细胞定位聚类减少了低密度背景信号，突显出CD81结合事件的聚集特征。我们能够观察抗体在细胞环境中与其膜表位的相互作用，从而为治疗性抗体的相关研究提供重要见解。

抗体浓度、非照射间隔时间以及光漂白步骤的优化至关重要。参数不理想将会影响实验结果。单抗体标记技术可进一步扩展，用于在同一细胞环境中同时评估多种抗体对膜蛋白的结合。