新生转录本与成熟转录本的RNA结构比较分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

我们研究了共转录的RNA加工过程，其中包括新生RNA在从合成它的RNA聚合酶中 emerging 时如何折叠。在本方法出现之前，我们无法监测RNA在合成过程中的折叠情况，这限制了我们的研究进展。因此，这一新方法弥补了这些不足。

CoSTseq 技术的开发旨在研究酵母中新生 RNA 的折叠过程。该方法在分析丰度较高的 RNA 时尤为有效。首先，将酿酒酵母菌株 BY4741 接种于 50 毫升 YPAD 培养基中，在 30 摄氏度、200 转/分钟振荡条件下培养，直至菌液达到对数中期。

收集约三毫升酵母培养物，其对应的光密度值为1.8个单位，在4°C条件下使用预冷的离心机以2,500 × g离心3分钟。将上清液弃入废液容器中。用10毫升冷的磷酸盐缓冲液重悬沉淀物，并在4°C条件下再次以2,500 × g离心3分钟。

去除上清液，将酵母沉淀置于冰上保存。用10毫升预冷的0.5% Sarkosyl小心重悬酵母沉淀，避免产生气泡。将重悬的酵母在冰上孵育20分钟以促进通透化，然后在4°C下以400 × g离心5分钟收集细胞，并用P-1000移液器将通透化的酵母细胞重悬于100微升无核酸酶的水中。

制备含有新鲜添加的5毫摩尔二硫苏糖醇的2.5倍转录缓冲液工作液，并将2.5倍结构探针缓冲液预热至30摄氏度。在一支干净的2毫升离心管中，加入所有必需的反应组分并充分混匀。接着，向反应管中加入100微升已制备的酵母细胞，置于设定为30摄氏度、转速为每分钟500转的恒温混匀仪中孵育2分钟。

然后迅速加入200 µL预热的2.5X结构探针缓冲液和25 µL二甲基硫酸酯试剂。轻轻涡旋混匀两次，立即将离心管放回设定为30 °C、500 rpm的恒温振荡器中。继续在恒温混匀仪中孵育4分钟，各样本间隔30秒。

提前配制终止缓冲液和洗涤缓冲液，并置于冰上预冷备用。向反应管中加入一毫升终止缓冲液，以终止二甲基硫酸酯甲基化反应。随后将经二甲基硫酸酯标记的样品在预冷的离心机中于 3,500 × g 离心五分钟。

离心后，将上清液弃入适当的废液容器中。向沉淀中加入1毫升预冷的洗涤缓冲液并重悬。以3,500 × g再次离心5分钟。

立即进行RNA提取，不要冷冻酵母沉淀。将二甲基硫酸酯标记的酵母沉淀重悬于600 µL RNA裂解缓冲液中，然后将悬液转移至含有40 µL 20%十二烷基硫酸钠的离心管中。在65 °C下孵育样品30秒，同时以950 rpm振荡。

接下来，按照标准操作程序进行RNA的苯酚-氯仿抽提。涡旋振荡链霉亲和素磁珠，并将44 µL磁珠转移至新的离心管中，每管对应80 µg总RNA样品。将磁珠置于磁力架上，直至磁珠完全沉降。

去除保存缓冲液后，将磁珠重悬于1毫升预洗缓冲液A中。室温孵育2分钟，然后置于磁力架上分离并弃去上清液。洗涤后，将磁珠重悬于88微升2×结合缓冲液中。取80微升该悬液转移至无菌的1.5毫升离心管中，管中已含有80微克生物素标记的RNA样品溶于80微升溶液中。

将珠子样品混合物在室温下于旋转仪上旋转20分钟。然后将离心管置于磁力架上，收集含有成熟RNA的流穿液，并将其保存用于沉淀，以通过DMS-MaPseq工作流程对成熟RNA进行poly-A筛选。接着，用500微升高盐缓冲液将珠子-新生RNA复合物清洗两次。

然后用 500 微升 1× 结合缓冲液洗涤一次，再用 500 微升低盐缓冲液进行最终洗涤。现在向磁珠-新生 RNA 复合物中加入 300 微升 RNA 试剂，充分重悬后，在 60 摄氏度的温控混匀仪中孵育 5 分钟。接着加入 60 微升氯仿，涡旋振荡，室温孵育 3 分钟。

将样品在预冷的离心机中于 14,000 × g 离心五分钟。最后，将上层水相约 180 微升转移至新的收集管中。弃去剩余的有机相，保留珠粒和残留的水溶液。

纯化新生RNA后，进行模板转换逆转录，连接5'接头，并对文库进行测序筛选。在1%琼脂糖凝胶上对PCR产物进行检测，结果显示引物二聚体形成极少，共转录结构追踪测序（CoSTseq）和DMS-MaPseq文库在约300个碱基对处呈现特征性弥散条带。CoSTseq样本1的毛细管电泳图谱证实文库大小分布集中在约285个碱基对处出现峰值。

ASC1 mRNA的比对结果显示，CoSTseq文库在内含子区域存在覆盖，证实该RNA为新生RNA；而DMS-MaPseq文库缺乏内含子覆盖，表明该RNA为成熟RNA。18S pre-rRNA的共转录折叠矩阵显示，随着RNA聚合酶在rDNA位点从第790位移动至第811位，DMS反应性呈现出急剧变化。

ADH1 mRNA 的 DMS 反应性分析显示，新生形式与成熟形式之间具有相似的图谱，表明存在结构稳定的区域。相比之下，SSA2 mRNA 在新生形式与成熟形式之间表现出不同的 DMS 反应性区域，提示其在成熟过程中发生了结构变化。利用 CoSTseq 技术，研究人员能够确定体内新生 RNA 的二级结构以及 RNA 聚合酶在 RNA 转录本上的位置。

CoSTseq 具有时间敏感的步骤，并使用有毒化学品。建议每次处理的样本不超过两个。从 CoSTseq 获得的总 RNA 中，非生物素化的 RNA 可用于结合传统的 DMS-MaPseq 进行成熟结构探针分析。