分子间RNA碱基配对的可视化与定量分析 体外 利用分裂型 Broccoli RNA 报告系统检测 RNA 簇

我们采用分裂的西兰花RNA报告基因检测方法，在体外检测和量化RNA簇中的分子间碱基配对。化学探针检测和模拟分析可提示RNA相互作用，但无法直接测量这些相互作用。本实验方案可实现对RNA簇内相互作用的直接、准确评估。

制备好体外 RNA 转录的 DNA 模板后，使用核糖核酸酶去污染溶液擦拭工作台面、离心管架和移液器。所有移液操作均应使用无核糖核酸酶的滤芯吸头。将转录试剂盒中提供的反应缓冲液、核苷酸溶液以及氰化物 5 标记的三磷酸尿苷（Uridine triphosphate Cyanine 5，或 UTP-Cy5）置于冰上解冻。

使用前将所有离心管在 2,000g 下离心两秒钟。然后计算 DNA 中胸腺嘧啶碱基的数量。在保持 RNA 物种标记密度一致的前提下，确定 20 微升转录反应所需的 UTP 和 UTP-Cy5 体积。

接下来，通过混合上述试剂配制一个20微升的转录反应体系。用移液器反复吹打充分混匀，并在2,000g下离心2秒。将反应体系在37摄氏度孵育6小时后，加入1微升试剂盒提供的脱氧核糖核酸酶，用移液器吹打充分混匀，再次离心。

然后在37摄氏度下额外孵育15分钟。将反应液转移至1.5毫升离心管中。加入115微升无核酸酶水和15微升试剂盒提供的乙酸铵终止溶液。

混合后，在2,000g离心两秒钟。接着，向管中加入150 µL苯酚氯仿，并轻轻混匀以使两相充分混合。在4°C条件下，于16,000g离心10分钟。

然后将上层水相转移至新离心管中。向转移后的溶液中加入等体积的氯仿，充分混匀以确保两相充分接触。随后在4°C条件下以16,000g离心2分钟，并再次重复相分离步骤一次。

然后将约100至150微升的水相转移至新管中。加入900微升异丙醇，并充分混匀。将溶液分装至不同的离心管后，于-20摄氏度保存过夜或长达一个月。

将RNA样品在异丙醇中于4摄氏度、16,000g离心15分钟。小心移除异丙醇，避免扰动RNA沉淀。然后向沉淀中加入1毫升用无核酸酶水配制的70%乙醇。

在4°C条件下，以16,000g离心两分钟。去除乙醇后，向管中加入1毫升用无核酸酶水配制的70%乙醇，并重复离心步骤。在最后一次乙醇洗涤过程中，使用1,000微升移液器吸出大部分乙醇。

在台式小型离心机中以2,000g短暂离心两秒，然后用20微升移液器吸除残留乙醇。待RNA沉淀干燥后，将其重悬于20微升无核酸酶水中。样品置于冰上并避光保存。

使用微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。确保260 nm与280 nm处的吸光度比值约为2.0，且260 nm与230 nm处的吸光度比值大于2.0。将一管100毫摩尔的亚精胺溶液和50%聚乙二醇8,000置于冰上解冻。

通过混合所示组分，新鲜配制10X RNA复性缓冲液。使用移液器充分混匀组分后，在台式小型离心机中以2,000g离心两秒钟。对于共折叠条件，在一个200微升PCR管中，加入含有上游或下游序列的体外转录RNA、RNA复性缓冲液以及无核酸酶水。

用移液器上下吹打充分混匀，并按之前所示进行离心。将样品在90°C下加热2分钟。立即转移至室温。

避光并孵育一小时。对于单独折叠条件，将RNA样本在200微升PCR管中加热，然后立即置于冰上至少15分钟。在200微升PCR管中，加入含有上游或下游序列的体外转录RNA、10倍RNA重折叠缓冲液以及无核酸酶水。

将反应物在室温下避光孵育30分钟。随后将含有上游和下游序列的RNA样品合并至同一个PCR管中，并通过反复吹打充分混匀。在台式小型离心机中以2,000g离心2秒。

室温孵育30分钟。两种条件下均加入6微升1:2的预混液，其中包含100毫摩尔的亚精胺和50%聚乙二醇8,000。混匀内容物后，在台式小型离心机中以2,000×g离心2秒。

现在将 2 µL 的 1 毫摩尔 DFHBI-1T 加入反应体系中，再次离心。将反应液加入玻璃培养小室盖玻片中。盖上盖子，于室温避光孵育 4 小时，以尽量减少蒸发。

将玻璃培养皿盖玻片装载到显微镜载物台上。打开激光器，然后通过目镜定位并聚焦样品。将显微镜设置为首先在每个Z平面使用Cy5通道对每个感兴趣区域进行成像。

然后使用绿色荧光蛋白通道对同一感兴趣区域进行成像。所有通道的曝光时间均设置为500毫秒。接着，将绿色荧光蛋白通道的激光功率设置为80%，氰5通道的激光功率设置为40%。

使用150纳米的Z步长，在室温下对反应液滴外部的盖玻片区域进行成像。随后，利用图像分析软件定量分析分子间碱基配对。在诱导RNA聚集后，两种RNA均能够单独或共同形成聚集体。

单独折叠的上链或下链RNA中，RNA簇内的DFHBI-1T荧光显著低于共折叠条件。在分别折叠条件下，归一化的DFHBI-1T信号为0.031，与单独存在上链或下链时观察到的基础水平相当。shu-top、shu-bottom、shu-anti-top和shu-anti-bottom各自均表现出极低的DFHBI-1T荧光。

将shu-top与shu-bottom共折叠，或shu-anti-top与shu-anti-bottom共折叠，产生的DFHBI-1T信号高于分别折叠。shu-top与shu-bottom共折叠导致标准化DFHBI-1T荧光强度增加5.63倍；而shu-top与shu-bottom分别折叠仅导致1.04倍的增加，与基线水平相当。

在两种折叠条件下，shu-top 与 shu-anti-bottom 混合，以及 shu-anti-top 与 shu-bottom 混合，其 DFHBI-1T 荧光强度均高于同取向配对。shu-top 与 shu-anti-bottom 以及 shu-anti-top 与 shu-bottom 共同折叠时，DFHBI-1T 荧光分别增强了 61.86 倍和 82.60 倍。而将这些混合配对分别折叠时，荧光增强分别为 2.69 倍和 4.94 倍。

最重要的考虑因素是，强健的信号生成可能需要添加拥挤试剂，而灵敏度则取决于分裂的 broccoli RNA 的高效二聚化和折叠。该检测方法可与 RNA 拉下实验和凝胶电泳技术相互补充，用于研究 RNA 簇中分子间的碱基配对。该检测方法能够考察 RNA 序列、解旋酶和离子对 RNA 簇内分子间碱基配对的影响。