DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridisierung und Scannen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Microarray-Experiment unter Verwendung einer automatisierten Mischvorrichtung durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Qualität der RNA-Proben mit dem Bioanalyzer nach der RNA-Amplifikation und -Markierung analysiert wird. Anschließend werden die RNA-Proben mit den Microarrays hybridisiert.

Schließlich werden die hybridisierten Mikroarrays gewaschen und gescannt. Letztendlich erhält man Ergebnisse, die die differentielle Expression von RNA-Transkripten durch die Analyse von Fluoreszenz-Mikroarray-Bildern mit zwei Farben zeigen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Hybridisierungsschritte bei Mikroarrays aufgrund der spezialisierten Ausrüstung schwer zu erlernen sind.

Die Qualitätskontrolle beginnt mit der Vorbereitung des Bioanalyzer-Instruments 2,100 und der Chip-Priming-Station gemäß der schriftlichen Anweisung. Die Gelmatrix wird anschließend filtriert, indem 550 Mikroliter in einen mit dem RNA 6,000 Nano Kit gelieferten Spin-Filter pipettiert werden. Der Filter wird 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 1.500 RCF zentrifugiert.

Anschließend portionsweise 65 Mikroliter des filtrierten Gels abfüllen, das bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius gelagert werden kann. Das Farbstoffkonzentrat 10 Sekunden lang verwirbeln und ein Mikroliter zu einer 65-Mikroliter-Portion hinzufügen. Ein filtriertes Gel, nachdem das Gemisch verwirbelt wurde, 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 13.000 RCF zentrifugieren, um die Proben aufzutrennen.

Platzieren Sie zuerst einen Chip auf der Anreicherungsstation. In dieser Demonstration werden RNA 6.000 Nano-Chips verwendet. Geben Sie neun Mikroliter der Gel-Färbemischung in das mit einem weißen G auf schwarzem Hintergrund markierte Loch.

Platzieren Sie die Pipettenspitze ganz unten in der Vertiefung. Stellen Sie den Spritzenkolben auf ein Milliliter ein und schließen Sie die Ansaugstation. Drücken Sie den Kolben langsam, aber gleichmäßig nach unten, bis er vom Clip gehalten wird.

Nach 30 Sekunden den Clip lösen und den Kolben einige Sekunden lang ansteigen lassen. Sobald der Kolben stehen bleibt, ziehen Sie ihn auf die Ein-Milliliter-Position zurück und öffnen die Entlüftungsstation. Geben Sie neun Mikroliter des Gelfarbstoffs ein.

Mischen Sie in jeweils zwei Vertiefungen. Geben Sie dann fünf Mikroliter des Markers in die Ladder-Vertiefung und in jede der 12 Probenvertiefungen. Laden Sie anschließend ein Mikroliter der denaturierten Ladder in die Ladder-Vertiefung und jeweils ein Mikroliter jeder denaturierten Probe in die Probenvertiefungen.

Fügen Sie abschließend je einen Mikroliter des Markers zu jeder ungenutzten Probe hinzu. Sobald der Chip beladen ist, wirbeln Sie ihn eine Minute lang bei 2.400 U/min vortex. Starten Sie danach die 2.100 Expert-Software, positionieren Sie den Chip und schließen Sie den Deckel.

Stellen Sie sicher, dass der richtige Port ausgewählt ist, und führen Sie den Assay innerhalb von fünf Minuten nach dem Beladen der Proben durch, um Verdunstung zu vermeiden. Methoden zur Durchführung der RNA-Amplifikation und -Markierung finden sich im schriftlichen Protokoll. Nach der Markierung reinigen Sie die cRNA, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen. Mithilfe von Cogens r einfachen Mini-Säulen kann die markierte cRNA anschließend mit einem NanoDrop 2000-Spektrophotometer quantifiziert werden.

Im Mikroarray-Messmodus Aufzeichnung, Probenkonzentration, Ausbeute und spezifische Aktivität erfassen. Für die Mikroarray-Hybridisierung ist es notwendig, mindestens zwei Stunden vor der Hybridisierung eine Ausbeute von mindestens 825 Nanogramm und eine spezifische Aktivität von mindestens acht Pikomol pro Mikrogramm zu erreichen. Schalten Sie die Hybridisierungsstation ein und stellen Sie sie auf 65 Grad Celsius ein.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Agilent-Vier-mal-40-4K-Arrays mit dem Roche-NimbleGen-Hybridisierungssystem und einer Vierfach-Mischkammer nach erfolgter CRNA-Fragmentierung, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, und die Vorbereitung der Hybridisierungskammer. Legen Sie einen Microarray-Slide in das Montage-/Demontagewerkzeug mit der Barcode-Seite nach oben. Öffnen Sie zunächst eine A4-Mischkammer und bringen Sie den Klebstoff, der das Array und das Montage-/Demontagewerkzeug fixiert, frei, um jegliche Bewegung zu verhindern.

Platzieren Sie den A-vier-Mischer auf dem Objektträger, beginnend am äußeren Ende. Stellen Sie sicher, dass er korrekt an das Werkzeug ausgerichtet ist, und befestigen Sie den Mischer entlang des Arrays. Ziehen Sie am Ende des Mixers, um die Objektträger-Mischer-Anordnung zu entfernen.

Drücken Sie mit dem Andrückwerkzeug entlang der gesamten Klebdichtung, um sicherzustellen, dass diese fest auf dem Objektträger haftet. Kleine Luftblasen, die zwischen dem Klebstoff und dem Objektträger eingeschlossen sind, sind vor dem dunklen Hintergrund sichtbar. Verwenden Sie zusätzliche Zeit, um diese Blasen mit dem Andrückwerkzeug zu entfernen.

Das Array ist nun bereit zum Beladen. Verwenden Sie eine Kolbenhubpipette, um 100 Mikroliter der Hybridisierungsprobe aufzupipettieren. Führen Sie die Spitze fest in die Ladeöffnung ein und geben Sie die Probe langsam und gleichmäßig ab, damit keine Luft im Array-Bereich eingeschlossen wird.

Wenn die Probe das gesamte Array bedeckt und die Flüssigkeit beginnt, schnell aus dem Entlüftungsanschluss auszutreten, entfernen Sie die Pipette, indem Sie nur den Kolben loslassen. Sobald die Spitze von dem Objektträger entfernt ist, tupfen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit an beiden Anschlüssen ab, wobei Sie darauf achten, die Probe nicht aus der Kammer selbst herauszuziehen. Anschließend verschließen Sie die Anschlussöffnungen mit Aufklebern, wobei Sie eine Pinzette verwenden.

Legen Sie den Objektträger auf die Hybridisierungsstation und überprüfen Sie, ob die Blasenlöcher korrekt über den O-Ringen positioniert sind. Dies gewährleistet eine ordnungsgemäße Durchmischung während der Hybridisierung. Schließen Sie die Objektträgerabdeckung und den Deckel der Station.

Stellen Sie die Station auf Mischmodus B ein und hybridisieren Sie das Array bei 65 Grad Celsius für 17 Stunden. Sobald dies abgeschlossen ist, füllen Sie eine mit „A“ beschriftete Glaswanne mit Waschpuffer eins; die Wanne sollte groß genug sein, um das Montage-/Demontagewerkzeug aufzunehmen und zusätzlichen Platz für Handhabung zu bieten. Alle Waschschritte sollten in Glasgeräten durchgeführt werden, da Kunststoff dazu neigt, Verbindungen auszulaugen, was zu einem hohen Hintergrund im Array führen kann.

Stellen Sie einen Objektträgerhalter und einen Rührstab in eine Färbeschale. Beschriften Sie diese mit B, füllen Sie die Schale mit Waschpuffer, sodass der Halter bedeckt ist, und stellen Sie die Schale bei Raumtemperatur auf ein Rührgerät. Geben Sie außerdem einen Rührstab in eine leere Färbeschale, die mit C beschriftet ist, und stellen Sie sie auf ein Rührgerät.

Entfernen Sie das Array aus der Hybridisierungsstation und legen Sie es in das Montage-/Demontagewerkzeug. Tauchen Sie die gesamte Montage unter, während Sie das Montage-/Demontagewerkzeug und den Objektträger mit einer Hand von entgegengesetzten Seiten festhalten. Heben Sie vorsichtig den A-vier-Mischer ab, wobei Sie darauf achten, den Array-Bereich nicht zu verkratzen.

Platzieren Sie die Objektträger schnell auf dem Gestell und in die Färbeschale B. Die Exposition gegenüber Luft sollte minimiert werden, da der SCI Five-Farbstoff ozonempfindlich ist. Waschen Sie den Abstreifer eine Minute lang unter mittlerer Rührgeschwindigkeit. Füllen Sie die Färbeschale C mit dem vorgewärmten Waschpuffer zwei.

Überführen Sie die Objektträger und waschen Sie sie eine Minute lang. Nach der Wäsche entfernen Sie den Objektträgerhalter sehr langsam aus dem Färbegefäß C, um Tropfen, die auf dem Objektträger zurückbleiben, zu minimieren. Trocknen Sie den Objektträger durch Zentrifugation für zwei Minuten.

Danach die Objektträger in ein 50-Milliliter-Konischglas geben und sofort mit Argongas spülen, gefolgt von einer Abtastung mit dem GenePix 4,000 B Scanner von Molecular Devices, um Signalverluste zu vermeiden, wie gezeigt. Hier sind Beispiele für vier RNA-Proben, die aus menschlichem Gehirn isoliert wurden. Die Qualität der Tumorgewebeproben wurde mittels des 2,100 Bioanalyzer auf einem RNA 6,000 Chip bewertet.

Voll- und offene Pfeilspitzen zeigen die Position der 18S- und 28S-rRNA-Spezies an. Die RNA-Integritätszahl (RIN) ist eine quantitative Messung der RNA-Qualität; hochwertige Gesamt-RNA-Proben sollten beim Laufen im Bioanalyzer zur Qualitätskontrolle nur zwei Hauptspitzen erzeugen, die den beiden wichtigsten ribosomalen RNA-Spezies entsprechen.

Eine gewisse RNA-Abbauerscheinung zeigt sich als Verschmierung vor dem ersten ribosomalen RNA-Peak und ein deutlich niedrigerer Peak für 28S-rRNA deutet auf starken Abbau hin. RNA geringer Qualität zeigt einen breiten Peak oder eine Serie von Peaks bei niedrigen Retentionszeiten. Dabei weisen die beiden ribosomalen RNA-Peaks eine sehr geringe Intensität auf oder sind überhaupt nicht erkennbar.

Arrays von guter Qualität sollten bei relativ niedrigen PMT-Werten ein starkes Signal erzeugen. Die meisten Transkripte sollten in der Versuchs- und Referenzprobe in ähnlichen Mengen vorhanden sein. Umfangreiche, weitverbreitete Veränderungen in der Genexpression werden wahrscheinlich keine biologische Bedeutung haben.

Daher sollte der größte Teil des Arrays gelb und nicht grün oder rot erscheinen. Hochwertige Signale sollten außerdem in einem dynamischen Bereich liegen, sodass die Signal-Histogramme vollständig überlappen, wie im Streudiagramm des Array-Bildes zu sehen ist. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Microarray-Experiment mit einem automatisierten Hybridisierungsgerät durchführt.