Micro-Mechanische Charakterisierung von Lungengewebe mit Atomic Force Microscopy

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das lokale mechanische Umfeld des Lungengewebes auf einer räumlichen Skala zu charakterisieren, die für residente Zellen relevant ist, indem die lokalen elastischen Eigenschaften von frischem Spiegelungslungengewebe mithilfe der Mikroeindrückung durch Rasterkraftmikroskopie direkt gemessen werden. Dies wird erreicht, indem das mit Agarose aufgeblasene Mauslungen-Gewebe mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell geschnitten wird, um Lungenparenchym-Streifen mit einer Länge und Breite von fünf mal fünf Millimetern und einer Dicke von 400 Mikrometern herzustellen. Anschließend werden die nicht fixierten, nicht permeabilisierten Lungen-Gewebestreifen immunhistochemisch gefärbt, um Bereiche von Interesse für die Mikroeindrückung mittels Rasterkraftmikroskopie zu identifizieren.

Danach wird eine Mikroeindrückprüfung mit einer Kraftmesssonde an Gewebestreifen in PBS bei Raumtemperatur durchgeführt, um die lokalen elastischen Eigenschaften des frischen Lungengewebes direkt zu messen. Die Ergebnisse zeigen auffällige Unterschiede im Bereich und in der Verteilung der Gewebesteifigkeit zwischen normalem und fibrotischem Lungengewebe sowie große räumliche Variationen der Steifigkeit, insbesondere innerhalb der fibrotischen Lungeprobe.

Basierend auf Steifigkeitskarten, die aus erzwungenen Verschiebungskurven gewonnen wurden, die mittels einer mikromechanischen Eindringprüfung mit einer Kraftmikroskopie (FM) aufgenommen wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Messmethoden wie dem Dehnen von Gewebestreifen liegt darin, dass sie eine beispiellose räumliche Auflösung bietet und somit einen einzigartigen Einblick in die mikroskaligen Variationen der Gewebesteifigkeit ermöglicht. Diese Messung kann helfen, zentrale Fragen zu beantworten, beispielsweise wie sich die Steifigkeit räumlich innerhalb des Gewebes verändert und welches Ausmaß sowie räumliche Skala die Steifigkeitsänderungen bei der Erkrankung aufweisen.

Prozesse, die zu einer Gewebeumgestaltung führen. Um Streifen aus Lungengewebe vorzubereiten, beginnen Sie mit der Stabilisierung der Lungenstruktur zum Schneiden, indem Sie isolierte Mauslungen über die Trachea mit 50 Milliliter pro Kilogramm Körpergewicht warmer, 2 %iger Low-Gel-Point-Agarose, die in PBS hergestellt wurde, aufblasen. Binden Sie die Trachea ab und kühlen Sie die aufgeblasenen Lungen 60 Minuten lang in einem Bad aus PBS bei vier Grad Celsius. Die Agarose wird in den Luftwegen gelieren und versteifen, wodurch die Lungenstruktur sanft stabilisiert wird. Während dieses Zeitintervalls schneiden Sie das agarosestabilisierte Lungengeweise der Maus mit einem Rasiermesser oder Skalpell in Streifen von etwa fünf mal fünf Millimetern Länge und Breite sowie 400 Mikrometer Dicke.

Anschließend die Streifen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in PBS waschen, um restliches Aros zu entfernen, um große Atemwege und Gefäße auszuschließen. Wenn große Atemwege und Gefäße abgebildet werden sollen, Streifen aus subpleuralen Regionen fernab der Hauptbronchien schneiden; wenn Bereiche von Interesse für eine FM-Mikroeindrückung isoliert werden sollen, Streifen aus Lungengewebe näher zu den Hauptbronchien schneiden. Das Gewebe mittels Hellfeldmikroskopie oder Immunfärbung sichtbar machen und mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisieren.

Bitte beachten Sie den schriftlichen Teil dieses Protokolls für das Verfahren. Unmittelbar vor einer FM-Charakterisierung befestigen Sie die Gewebestreifen an mit Poly-L-Lysin beschichteten 15-Millimeter-Deckgläsern, indem Sie das Deckglas von unten an das schwimmende Gewebe heranführen und sicherstellen, dass sich der Gewebestreifen gleichmäßig auf der Oberfläche des Deckglases ausbreitet. Falls erforderlich, können Sie den Streifen mit einem zweiten sauberen, unbeschichteten Deckglas abdecken und sanften Druck ausüben, um die Anheftung des Gewebes an das mit Poly-L-Lysin beschichtete Deckglas zu unterstützen.

Kalibrieren Sie das AFM-System unmittelbar vor jeder Runde von Mikroeindruckversuchen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bestimmen Sie dazu zwei kritische Parameter: die Federkonstante des Cantilevers mit der Thermalschwankungsmethode in Luft und die Ablenkungsempfindlichkeit des Cantilevers, ein Parameter, der verwendet wird, um das Ausgangssignal der Photodiode auf die tatsächliche Ablenkungsdistanz des Cantilevers umzurechnen.

Kalibrieren Sie die Ablenkempfindlichkeit, indem Sie eine Standard-Kraft-Weg-Kurve in PBS auf einem sauberen Glasobjektträger aufnehmen. Berechnen Sie anschließend die Steigung der Kraft-Weg-Kurve aus der Kraft-Weg-Kurvenmessung. Die AFM-Spitze wird an einer einzelnen Position zur Probenoberfläche hin ausgestreckt und von ihr zurückgezogen, wobei die Ablenkung des Cantilevers ΔD als Funktion der Spitzenverschiebung ΔZ überwacht wird. Es wird empfohlen, einen dreieckigen Siliziumnitrid-Cantilever mit einer fünf Mikrometer durchmessenden borosilikatgläsernen kugelförmigen Spitze zu verwenden, und zwar mit FM-Sonden mit einer Federkonstante von 0,06 Newton pro Meter.

Wir haben weiche Materialien mechanisch charakterisiert, deren Schermodul zwischen 100 und 50.000 Pascal liegt. Wischen Sie die Unterseite des Probenobjektträgers mit einem Papiertuch ab und befestigen Sie ihn anschließend mit Vakuumfett auf einem Standard-Glasobjektträger. Bringen Sie den Glasobjektträger auf der AFM-Probenhalterung an und bedecken Sie das Papiertuch mit 500 Mikrolitern PBS bei Raumtemperatur.

Platzieren Sie dann einen FM-Scanning-Kopf über der Probe. Justieren Sie den Mikroskop-Probenhalter, um das Mikroskop für die Betrachtung durch das Okular einzustellen und die A-FM-Spitze in der Mitte des Sichtfeldes auszurichten. Bewegen Sie den A-FM-Probenhalter, um einen interessierenden Bereich im Gewebe auszuwählen.

Wechseln Sie dann zur CCD-Kamera-Ansicht, um Phasenkontrastbilder und/oder Fluoreszenzbilder des Gewebes nach Bedarf aufzuzeichnen. Bewegen Sie die AFM-Spitze langsam nach unten, bis sie genau mit der Probe in Kontakt steht. Eine mikroinduktive Charakterisierung weicher Proben mittels AFM erfordert geringe Eindringtiefen, um große lokale Dehnungen zu vermeiden, die das Hertz-Modell, das zur Berechnung des elastischen Moduls verwendet wird, ungültig machen. Um große Dehnungen zu vermeiden, führen Sie die Eindringung im Auslösermodus durch, indem Sie die maximale Auslenkung des Cantilevers auf 500 Nanometer einstellen.

Diese Ablenkungsgrenze begrenzt die maximale Eindrückkraft auf weniger als 30 Nanonewton. Die Eindrückgeschwindigkeit sollte ausreichend langsam gewählt werden, um die elastischen statt der viskoelastischen Eigenschaften der weichen Probe zu untersuchen. Wählen Sie für eine Einzelmessung aus einem Bereich von Interesse einen Geschwindigkeitsbereich von zwei bis 20 Mikrometern pro Sekunde für Lungengewebe.

Bewegen Sie die A-FM-Sonde an die gewünschte Position und führen Sie eine einzelne Eindrückung durch, um eine Standard-Kraft-Weg-Kurve aufzuzeichnen. Die Sonde bewegt sich dabei ausschließlich in Z-Richtung. Für die automatisierte Kartierung eines interessierenden Bereichs wechseln Sie in den Kraft-Kartierungsmodus, wählen Sie die Scan-Größe und die Abtastpunkte innerhalb des ausgewählten Bereichs.

Die AFM-Spitze bewegt sich zwischen den Eindrückbewegungen über die Probenoberfläche und erfasst an jedem Punkt innerhalb eines vordefinierten Probenrasters individuelle Kraft-Weg-Kurven. Es hat sich als praktisch erwiesen, ein 16-mal-16-Probenraster zu verwenden, um einen Bereich von 80 Mikrometer mal 80 Mikrometer bei einer Eindringgeschwindigkeit von 20 Mikrometern pro Sekunde abzubilden, was in etwa 10 Minuten abgeschlossen ist. Zur Berechnung des E-Moduls wird die Kraft-Weg-Kurve mithilfe der nichtlinearen Kleinste-Quadrate-Kurvenanpassung an das Hertzsche Modell für sphärische Eindrückung angepasst, wie hier dargestellt, wobei F gleich K-Index-C mal Delta-D ist, die Kraft zur Biegung des Cantilevers.

K sub C ist die Federkonstante des Cantilevers. R ist der Kugelspitzenradius, δ = δZ − δD ist die Eindrücktiefe, und ν ist das Poisson-Verhältnis der Probe, das für Lungengewebe 0,4 beträgt. Zur Beurteilung der Güte der Anpassung berechnen Sie den SSR-Wert (Summe der Quadrate der Differenzen zwischen den Daten und den Anpassungswerten) während der nichtlinearen Kurvenanpassung.

Eliminieren Sie unzuverlässige oder nicht interpretierbare Messungen, indem Sie Daten von schlechten Kurven mit hohen SSR-Werten verwerfen. Falls gewünscht, wandeln Sie das elastische Modul oder E in den Schubmodul G unter Verwendung der Beziehung E gleich zwei mal die Summe aus eins plus nu mal G. Um räumliche Steifigkeitsmuster, die im Kraftkartenmodus erfasst wurden, zu visualisieren, stellen Sie die Moduldaten und Isolinienkarten dar, beispielsweise in einem 16 mal 16-Gitter, das einen Bereich von 80 Mikrometern mal 80 Mikrometern abdeckt.

Um eine große Menge an Kraft-Kurven-Daten zu verarbeiten, kann ein benutzerdefinierter Algorithmus geschrieben werden, um Kraft-Weg-Kurven automatisch anzupassen, Module zu extrahieren und/oder Konturkarten oder ELA-Grafts darzustellen. Unter Verwendung der zuvor beschriebenen gleichen Verfahren und Parameter zeigt diese Abbildung, dass das Gewebe ordnungsgemäß geschnitten und angefärbt wurde. Die alveoläre Mikrostruktur des Lungenparenchyms ist, wie durch Immunfluoreszenz-Färbung für die Basalmembrankomponente Laminin ohne Fixierung oder Permeabilisierung beobachtet, gut erhalten.

Diese Bilder zeigen immunfluoreszenzfärbungen für Kollagen, eine an frischen, unbehandelten Lungen von Mäusen, die zuvor mit PBS oder mit Bleomycin zur Induktion einer Fibrose behandelt wurden. Hier dargestellte Kraft-Weg-Kurven, erhalten mittels einer Kraftmikroskop-Mikroeindrückprüfung bei gleicher aufgebrachter Kraft. Die AFM-Spitze erzeugt eine große Eindrückung in einem weichen Bereich, was zu einer relativ flachen Kraft-Weg-Kurve führt, dargestellt in Blau, im Vergleich zu einer kleinen Eindrückung und einer steilen Kraft-Weg-Kurve für einen steiferen Bereich, dargestellt in Rot.

Um nach jeder Eindrückung saubere Kraftkurven zu erhalten, muss die AFM-Spitze vollständig von der Probenoberfläche zurückgezogen und vor der nächsten Eindrückung kontaktfrei sein. Dieser kontaktfreie Zustand entspricht dem flachen Bereich der Kurve, in dem sich die Spitze ohne Auslenkung des Cantilevers bewegt. Diese Abbildung zeigt eine typische fehlerhafte Kurve ohne flachen Bereich, die auftritt, wenn die Spitze nicht vollständig von der Probenoberfläche zurückgezogen wird, beispielsweise wenn eine weiche Probe an der Spitze haftet, wodurch es unmöglich wird, den Kontakt­punkt zu bestimmen, falls die Spitze vollständig in der weichen Probe eingeschlossen ist.

Die Kurve kann wie folgt aussehen, ohne klare Ablenkung, jedoch mit geringem Rauschen. Diese Abbildung zeigt die Steifigkeit. Aus erzwungenen Verschiebungskurven gewonnene Daten werden räumlich als Steifigkeitskarten dargestellt, die als ELAs-Transplantat bezeichnet werden, wobei die Farbskala der Steifigkeit entspricht. ELAs-Transplantate zeigen auffällige Unterschiede im Bereich und in der Verteilung der Gewebesteifigkeit im normalen und fibrotischen Lungenparenchym sowie große räumliche Variationen der Steifigkeit, insbesondere innerhalb der fibrotischen Lungenprobe.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das lokale mechanische Umfeld des Lungengerüstes charakterisiert, indem man die lokalen elastischen Eigenschaften von frischem Lungengewebe mittels Rasterkraftmikroskopie direkt misst.